اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر
مقدمه
در گذشته براي توليد قطعات نوكلئوتيدي معمولا از روش هاي شيميايي استفاده مي‌كردند و یا برای بدست آوردن نسخه های متعدد از يک ژن خاص، اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير می نمودند. اين روش ها پر زحمت بوده و نياز به مدت زمان طولاني داشتند. تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction ) به منظور تکثیر یک قطعه DNA در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) کارمند شرکت Cetus ارائه شده است. PCR  مزاياي بسیاری داشت (از جمله بررسي يك روزه نمونه ها، ارزان بودن نسبي، آساني انجام و فوق العاده اختصاصي بودن) و انقلابي در تشخيص كلينيكي بيماري ها، پزشكي، علوم جنايي و پليسي، ميكروبيولوژي و بسياري صنايع ايجاد كرد. اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد و امروزه تقريباً در تمامی آزمايشگاههای زيست مولکولی جزو کارهای متداول بوده و به صورت اتوماتيک بوسيله ی کامپيوتر انجام می شود. به دلیل همین كشف در سال ۱۹۹۳، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید. PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود. با اين روش مي توان يك ژن را به اندازه اي تكثير كرد تا بتوان با استفاده از روش‌هايي مانند الكتروفورز مشاهده كرد. شما يك تار مو را از فاصله 6 متري نمي توانيد ببينيد اما يك دسته ميلياردي از مو كنار هم به خوبي مشاهده مي شوند. اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA  پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase  به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها استفاده می شود. در این تکنیک ابتدا پرايمراز DNA  موردنظر، طراحي مي شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تكثير كرده و توسط الكتروفورز در مقابل يك كنترل مي سنجند.

مواد و وسایل لازم برای PCR

DNA الگو (TemplateDNA) PCR تكنيكي است كه به واسطه آن مي توان از يك رشته DNA الگو، تعداد زيادي رشته DNA به دست آورد به شرطي كه دو انتهاي رشته ی  DNAكه قصد تكثيرش را داريم كاملا شناخته شده باشد. قطعه ی DNA می تواند محصول استخراج DNA ژنومی،DNA  پلاسمیدی یا حتی محصول  PCRدیگری باشد. چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA  پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل وEDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد. در مواد غذایی روند زیر برای تهیه DNA  وجود دارد.

2- دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTPs) چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعهDNA ، بلوک های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند و باید كنار هم چيده شوند تا رشته مكمل را ايجاد كنند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده، واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتریPCR  باید 5 میکرولیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

3- پرایمرهای Forward و Reverse پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNAی مورد نظر هستند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف، همانند سازی و تکثیر می گردد. از آنجائيکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند؛ اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. طول پرايمرها نیز بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند. بهتر است دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغیر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و نقش بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد.

طراحی پرایمر : پرایمرهای PCR بصورت کاملا” اختصاصی و مکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند. پرایمرها 30-20 باز دارند .اگر پرایمرها خیلی کوتاه باشند ممکن است با بخشهای غیر هدف هیبرید شوند و سبب تکثیر محصولات ناخواسته شوند. پرایمرهای بلند با اینکه موجب تولید محصول اختصاصی میشوند ولی باعث کاهش سرعت هیبرید شدن آن با DNA می شود. به همین دلیل در عمل از پرایمرهایی با طول بیش از  30 نوکلئوتید بندرت استفاده می شود. برای تکثیر توالیهای بزرگ از کلون کردن استفاده میشود. پرایمر باید دمای آنیلینگ بالا داشته باشد. دمای مناسب برای تشکیل هیبریدهای صحیح الگو وپرایمر 1 تا 2 درجه پایین تر از دمای ذوب شدن (T_m) است. فرمول محاسبه دمای ذوبT_m=4(G+C)+2(A+T)  است.  (A+T) مجموع نوکلئوتیدهای آدنین و تیمین موجود در پرایمر و  (C+G)مجموع نوکلئوتیدهای گوانین وسیتوزین موجود در پرایمر است. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته باشند. چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا” سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل می شود. فاصله دو پرایمر باید کمتر از 10 kb باشد (کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از 3kb کمتر است). برای پرایمرهایی که برای ایجاد موتاسیون در یک ژن و ایجاد تغییر در محصول PCR طراحی میگردند میتوان درسمت پایه 5` پرایمر یک پروموتور و یا Ribosom Binding Site جایگاه اتصال ریبوزوم تعبیه نمود، همچنین می توان یک Non tanslated leader بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR  گفته می شود. نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژن های دیگری می توانندAnneal گردند.

4- Taq DNA polymerase DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت 5َ    3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت 3َ   5َ می سازد.  در مرحله همانند سازی، برای جدا نمودن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. در ابتدای طراحی PCR از آنزيم کلینو پليمراز I (DNA پليمراز E.coli) استفاده میشد ولی از آنجا که اين آنزيم به حرارت حساس است، پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. Saiki يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه را انجام داد و متوجه شد که باکتريهای چشمه های آب گرم (برای مثال باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) ) دارای DNA پليمرازهايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند. این DNA پليمراز که بطور خلاصهTaq پليمراز ناميده می شود در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد. بنابراین با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نیست و PCR براحتی و به صورت اتوماتيک انجام می شود. در حال حاضر Taq پليمراز برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنشPCR  استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. مزيت بسيار مهم ديگرTaq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد. در دمای پايين (30 درجه سانتی گراد که برای DNA پليمراز E.coli بکار می رفت) پرايمرها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمرها نياز است. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتيمم فعاليتTaq پليمراز انجام شود اتصال پرايمرها به نواحی غير از ناحیه ی اصلی کاهش می يابد. به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. 5-بافر بافر شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA  الگو (نمونه) کمک می کند. بافر به صورت 10 x ساخته مي شود.

6-کاتیون های دو ظرفیتی(یون های منیزیم یا منگنز) و کاتیون های یک ظرفیتی(یون پتاسیم) یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA  polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون (عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم(Mgcl₂)) برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم Taqپلي مراز دارد و موجب تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) می گردد و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و کاهش میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

7-روغن معدني mineral oil برای جلوگیری از تبخیر محلول در دستگاه چرخش حرارتي و در نتیجه افزایش غلظت در بخش های بالائی محلول، معمولا یک لایه روغن (معمولا 50 تا 60 ميكروليتر به محلول واكنش 100 ميكروليتري) بر سطح محلول اضافه مي شود. در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده می شود.

8-ترموسایکلر دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی) قابل برنامه ریزی برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

9-ظروف مورد استفاده میکرو پیپت (برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرولیتر)، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند سمپلر، سر سمپلر) تیپ -جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود)، ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها. محلولPCR معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک 2/0 تا 5/0 میلی لیتر تهیه می شود. این لوله ها در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده می شوند.

مراحلPCR 1- مرحله واسرشت (Denaturation step) این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد. هرچه زمان Ramp (زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد) کمتر باشد نتیجه کار بهتر است و واکنش، زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار می گیرد. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.

2-مرحله اتصال(Annealing step) دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به 3۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این دما دو رشته هر مولکول میتوانند دوباره به یکدیگر متصل شوند ولی این اتفاق نمی افتد زیرا مخلوط حاوی مقدار بیشتری مولکول های کوچک DNA به نام پرایمر(Primer) است که معمولا از 25-18 باز آلي تشكيل شده اند و به DNAی تک رشته ای الگو متصل می شوند. دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA بر اساس قوانین معروف واتسون- کریک دارد و در واقع برگرفته از آن است. همیشه A با T و G با C جفت می شود. بنابراین پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند و رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

3-مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/elongation step) آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر- الگو، با اضافه کردن نـوكـلـئـوتـيـد تـري فـسـفـات‌هـاي موجود در محلول بر روی عامل-OH  َ۳ پرایمرها همانند سازی DNA را آغاز کرده و رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد. دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب می شود. مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز، تعداد بازهای بین دوپرایمر و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود.

4-ادامه PCR بعد از چرخه اول بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام مي‌شود و چـرخـه ‌هاي بعدي تكرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد. بار ديگر سيستم گرم می شود و در اينجا هشت نسخه بوجود مي آيد، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي و به نسبتⁿ2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. به طور مثال یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر می شود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب می شود. لازم به ذکر است که DNA های کوتاه (Short target product) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential) و DNA های بلند (long target product) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می باشند بصورت تصاعد حسابی (linearly) زیاد می شوند.

5-مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation) این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (T_m)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

6-نگهداری نهایی (Final hold) در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

7-ردیابی (detect) محصول PCR نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، الکتروفورز نمودن همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) و یا رنگ آميزی اتيديوم برومايد بررسی نمود.

کاربردهای PCR 1-تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد با استفاده از PCR و به كار گرفتن پرايمرهاي مربوط به يك ژن بيمار و پرايمرهاي مربوط به ژن سالم آن، مي‌توان از تولد كودكان داراي بيماري‌هاي ژنتيكي جلوگيري كرد. براي اين كار بعد از لقاح تخمك در آزمايشگاه و بعد از رسيدن تخمك به حالت 10 سلولي، تعدادی از سلولهای جنين را استخراج کرده و با پرايمر اختصاصی برای يک ژن بيماری مجاور مي کنند، همچنين بطور جداگانه با پرايمر ژن سالم نيز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند. پس از پايان PCR تفسير آزمايش چنين خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود، جنين يک ژن سالم و يک ژن بيمار دارد يعنی حامل است ولی بيمار نيست. اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بيمار وجود دارد انجام شود جنين بيمار است و بايد سقط شود. اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود، جنين کاملاَ سالم است. امروزه بسياری از بيماريهای ژنتيکی مانند هموفيلی، کم خونی داسی شکل، سيستيک فيبروزي(Cystic Fibrosis )، تالاسمی، سندرم لش – نيهان، ديستروفی عضلانی دوشن، فاويسم، فنيل کتون اوری و غيره را می توان به کمک PCR تشخيص داد.

2-تعيين جنسيت جنين به طور معمول چند تخمك با چند اسپرم در آزمايشگاه لقاح مي‌يابند و هر يک از سلولهای تخم تشکيل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اينکه جنين به مرحله ی 10 سلولی برسد. سپس از هر جنين يک سلول را جدا کرده و همراه با پرايمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند. كروموزوم y منحصرا در سلول‌هاي نر ديده مي‌شود. قطعه توليدشده با PCR به وسيله الكتروفورز و به طور دقيق‌تر توسط ساترن بلوتينگ تشخيص داده می شود. فقط در هر لوله که جنين نر ( يعنی کروموزوم y) وجود داشته باشد، سنتز DNA صورت می گيرد. با این روش می توان به اختيار جنسيت جنین را انتخاب کرده و تخم مورد نظر را به مادر انتقال داد. تمامی مراحل بالا يعنی استخراج تخمک از مادر، لقاح، تکثير،PCR  و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان يک روز قابل انجام است. راه ديگر تعيين جنسيت جنين استفاده از خون مادر است. در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنين وارد خون مادر می شوند. حال اگر PCR برای قطعه ی  DYZl (در حدود 5000 نسخه از اين قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم y ندارد پس اين ژن مربوط به کروموزوم y جنين است و جنس جنين نر تعيين می شود.

3-تشخیص بیماری ها در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده می شود. کشت ميكروب ها كه جهت تشخيص بيماري‌هاي عفوني در بيشتر آزمايشگاه ها به كار مي‌رود زمان ‌بر بوده و همچنين باعث افزايش تعداد ميكروب ‌هاي بيماري زا و غير‌بيماري‌زا در شرايط آزمايشگاهي مي شود. بدلیل حساسیت بالای PCR (حساسیت این روش ده هزار برابر روش های معمول است) می توان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسم ها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.

4-تشخیص سرطان و بررسی مراحل درمان آن در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام می شود. در هر سلول معمولاَ از يک ژن فقط يک نسخه وجود دارد، و در صورتی که اين ژن دچار جهش شود بررسی اين جهش بسيار مشکل خواهد بود، زيرا در سلول های انسان پيدا کردن يک ژن در ميان کل ژنوم انسان، همانند پيدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پيدا کردن ژن جهش يافته نيز به دليل محدوديت نسخه های اين ژن بررسی کميت و کيفيت جهش در آن مشکل خواهد بود. ولی امروزه PCR کار را بسيار راحت نموده است. کافی است که يک سلول سالم و يک سلول جهش يافته بطور جداگانه برای يک ژن خاص تحت PCR قرار گيرند و محصولات حاصل با هم مقايسه شوند. به اين ترتيب به راحتی می توان محل جهش، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم ديگر را به دست آورد. استفاده ديگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد. داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سيتوتوکسيک می باشد که عوارض جانبی بسيار زيادی به همراه دارند. به همين دليل نيز سرطان شناسان مايل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بين رفتن سلول بدخيم درمان را متوقف نمايند، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد، احتمال عود مجدد بيماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعيين سلولهای سرطانی بسيار بالا می رود وPCR  منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت.

5- شناسائی میکروارگانیسم هایی که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است با استفاده از روشPCR  و با بررسي حضور يا عدم حضور يك ژن مي ‌توان وجود میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses) را بررسی نمود و بطور مثال تشخيص داد كه آيا ويروس ايدز در داخل بدن وجود یا نه؟‌ فرض كنيد بيمار شما به يك بيماري نا‌شناخته گرفتار است و شما احتمال مي دهيد كه عامل بيماري ويروس است. اين ويروس را نمي شود به راحتی در آزمايشگاه كشت داد. با روش PCRمي توان احتمال اين ويروس را در عرض 1 ساعت كنترل كرد. يعني نمونه اي از بدن بيمار و همچنين قطعه‌اي از ژن اين ويروس كه پرايمر نام دارد را به دستگاه مي دهيم. اگر حتي فقط 1 عدد از اين ويروس در نمونه بيمار باشد دستگاه از ژن آن ميلياردها كپي تهيه مي كند. سپس مي توان اين حجم زياد ژن را در صفحه فيلم فلورسنت حاصل از الكتروفورز مشاهده كرد. اگر باند هايDNA روي ژن ديده شد مطمئن مي شويم كه بيمار ناقل اين ويروس است. استفاده ديگر PCR در تشخيص بيماری سل می باشد. مايکوباکتريوم توبرکلوزيس يک باکتری بسيار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بيماری سل از نمونه ی خلط فرد بيمار به همراه پرايمرهايی که برای توالی خاص مايکوباکتريوم های مکمل می باشند، مورد استفاده قرار می گيرد. پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوش های مختلف مايکوباکتريوم ها قرار می گيرد و به اين صورت، گونه و سوش آن تشخيص داده می شود.

6- تحقیقات جنایی (forensic analysis) در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابراین با روش PCR می توان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکول های ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی می شود.

7- انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting) با روش PCR می توان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.

8-بررسی DNA قدیمی (ancient DNA) با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمی حتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یک ماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیک بررسی شده است.

9-جداسازی DNAی ژنومی با روش PCR می توان بخش هایی از DNAی ژنومی را انتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولید شاخص های دورگه سازی (hybridization probes) در روش های Southern و Northern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیه است. همچنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCR می توان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.

10-تعیین توالیDNA پس از تکثیر DNA با روش PCR، می توان توالی نوکلئوتیدی را تعیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAی کروموزومی در یوکاریوت ها الحاق نمود و بدین ترتیب DNA ی نوترکیب (recombinantDNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد می توان سریعا با استفاده از PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرار داد.

11-تعيين توالي های کروموزومی انسان در سلول های هيبريدی هتروکاريوتها يکی از تکنيک های بررسی ژنوم انسان، تلفيق (هيبريد کردن) هسته های سلول های انسانی با سلول های حيوانات ديگر مثلاَ موش است. پس از انجام تلفيق دو هسته، کرومزوم های انسان به تدريج حذف می شوند، تا اينکه نهايتاَ يک کروموزوم در درون هسته هيبريدی باقی می ماند. حال گاهی به منظور بررسی های بيشتر لازم می شود که اين قسمت های ژنوم انسان تکثير شوند، مثلاَ وقتی که يک ژن خاص مورد بررسی قرار می گيرد. برای اين کار از نوع خاصیPCR  که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود. در اين روش از پرايمرهايی استفاده می شود که مکمل توالي های بسيار تکراری ژنوم ها می باشد، اين توالی های 300 جفت بازی که گاهی تا 900000 بار در ژنوم انسان و ديگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند. اين توالی ها بسيار متغير می باشند ولی در انسان قسمتی از اين توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همين دليل به راحتی می توان از آن برای تکثير قطعات DNA که بين دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد. سپس اين DNA  را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئين مورد سنتز و يا تعيين توالی و غيره مورد بررسی قرار داد. مهمترين استفاده روش فوق تعيين مکان ژنتيکی ژن های مختلف برروی کروموزوم های انسان است که تا قبل از اين روش تقريباَ ناممکن و يا بسيار مشکل بود.

12- بررسی پيوستگی ژن ها و تعيين فاصله ی بين ژن ها بر روی کرومزوم های انسان در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژن ها از بررسی تعداد نوترکيب ها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود. اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتی قابل انجام است؛ ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ی زمانی زياد می باشد، اين بررسی ها به سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد. ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR  روش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند. برای اين کار از بررسی آلل های موجود در يک اسپرم استفاده می شود. از آنجائيکه اسپرم ها هاپلوئيد بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم يک عدد وجود دارد، با بررسی همزمان دو ژن بر روی يک کروموزوم و تعيين ميزان نوترکيبی بين اين دو ژن می توان فاصله ی ژنتيکی بين دو ژن را تعيين کرد. در واقع از نظر ژنتيکی بررسی 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند يک خانواده برابر است. با استفاده از اين روش ثابت شده است که ميزان نوترکيبی کرومزوم ها در مردها با ميزان نوترکيبی در زن ها متفاوت است.

13-کلونینگ باPCR قرار دادن جایگاه شناسایی آنزیم های برش دهنده در طرف 5` سکانس پرایمر: این روش مشکلاتی نیز دارد. این جایگاه ممکن است روی قطعه همانند سازی شده نیز وجود داشته باشد. استفاده از جایگاه دو آنزیم متفاوت در هضم اشکال ایجاد میکند که برای رفع این مشکل باید تعدادی باز به انتهای 5` پراپمر اضافه شود. Blunt end ligation: برای اینکار دو انتهای قطعه همانند سازی شده باید Polish شود. این کار توسط آنزیم های کلنو و 4 DNA polymerase (پرکردن قسمت over hang) و یا آنزیم های S₁ nuclease و Mong bean nuclease انجام می شود. T vector : پلاسمید ناقل را با آنزیم EcoRV ویا هر آنزیم دیگرکه DNA را بصورت Blunt برش میدهد هضم میکنند، سپس توسط آنزیم Terminal transferase یا آنزیم Taq poly تعدادی T به انتهاهای 3` رشته های پلاسمید خطی شده اضافه میکنند .( لازم به ذکراست که آنزیم Taq poly دارای خاصیت ترمینال ترانسفرازی است و تعدادی A به انتهای 3` محصول آمپلی فای شده اضافه میکند). با انجام واکنش Ligation پلاسمید و محصول PCR را بهم متصل میکنند. تولید نیمه جایگاه شناسایی یک آنزیم برش دهنده در طرف 5` پرایمر. قطعات باT4 poly nucleotidkinase و ATP فسفریله میشوند و سپس بهم متصل میگردند، بعد توسط یک آنزیم هضم شده و کلونینگ انجام می گیرد. کلون کردن محصول PCR به روش T-A cloning : پلاسمید با یک آنزیمی که DNA را بصورت blunt قطع میکند هضم می شود. سپس توسط آنزیم ترمینال ترانسفراز یا Taq پلیمراز و dTTP یک باز T به انتهاهای  OH- 3` آن اضافه میگردد. واکنش Ligation از این وکتور با محصول PCR که در انتهاهای OH- 3` آن باز A قرار دارد انجام می گیرد و پلاسمید در یک باکتری ترانسفرم می شود.

مشکلات PCR با تمامی مزيت های فوق در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت هایی نیز وجود دارد که مهمترین آنها اندازه قطعات قابل تکثیر می باشد به طوری که حداکثر اندازه قطعه هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می گردد، 5 هزار نوکلئوتید (kb 5) و در روش های بهینه شده تا 20 هزار نوکلئوتید (kb 20) می باشد. مشکل اساسی دیگرPCR  آلودگی نمونه های مورد بررسی است. به دليل حساسيت فوق العاده و قدرت تکثير زياد PCR  هر قطعه DNA خارجی که وارد محيط PCR شود، مورد تکثير قرار گرفته و نتايج عجيب و دور از واقعيتی به وجود خواهد آورد. برای مثال در مورد تحقيقی که در تعيين جنسيت با استفاده از خون مادران باردار بيان شد، در بين جواب ها يک مورد مثبت کاذب برای يکی از زنان غير باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود، وجود داشت. پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچيزی از سلولهای پوست يکی از کارکنان مرد آزمايشگاه وارد لوله ی PCR شده است. گاهی نيز باقيمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثير DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود. براي رفع مشكل، امروزه از ظروف يك بار مصرف استفاده مي‌شود. كليه ظروف قبل از استفاده اتوكلاو مي‌شوند تا سلول‌ها و مولكول هاي موجود در آن ها، تا حد ممكن غير فعال مي‌شوند. يـكــي از روش‌هــاي پـيـشـنهـادي انجـام PCR داخـلــي يـا Nested PCR اسـت. از ايـن روش بـا استفـاده از دو پرايمر قطعه‌اي از DNA را تكثير مــي‌دهـنــد و سـپــس قـطـعــه‌اي ديـگــر در داخـل DNAهــاي تـكـثـيــر شــده PCR مــي‌شــود. بــديــن صورت احتمال آلودگي كاهش مي‌يابد. یکی دیگر از محدودیت های روش PCR ، دناتوره و غیر فعال شدن آنزیم بعد از 25 تا 30 سیکل بعلت حرارت است، همچنین غلظت زیاد رشته های هدف موجب  Reannealing آنها شده و باعث می شود آنها با پرایمرها رقابت کنند.حضور چربی ها، پروتئین ها، آنزیم ها، افزونی های شیمیایی، ترکیبات فیبری و محدوده های متفاوت pH بر فرایند PCR تاثیر می گذارند. ارگانیسم های غیر بیماریزای موجود در فراورده های غذایی تخمیری، ارگانیسم های موجود در خاک و کودهای مصرفی، آلودگی مدفوعی گوشت، نوعی DNA  رقابتی به وجود خواهد آورد. گاهی ترکیباتی به واکنشگرهای PCR متصل شده و آنها را تخریب می کنند به نحوی که مانع از مشارکت آنها در سنتز DNA و انجام واکنش  PCR میگردند این ترکیبات بازدارنده  PCR نامیده میشوند و عمدتا شامل گیرنده های کاتیونی و ترکیباتی هستند که با اتصال به پلیمراز یا  DNA الگو آنها را کاهش می دهند. بازدارنده های اختصاصی در هر نوع ماده غذایی ازجمله گوشت، شیر، پنیر، فراورده های غذایی تازه و ادویه جات و … یافت میشوند. به عنوان مثال شیر دارای مقدار بالایی کاتیون های ca²⁺، پروتئاز نوکلئاز، اسیدهای چرب و DNA  است. هم، نمکهای صفراوی، اسیدهای چرب، آنتی بادی و کلاژن بازدارنده های PCR هستند که در گوشت و جگر وجود دارند.برای کاهش تاثیر این عوامل جداسازی مناسب عامل بیماری زا از بافت ماده غذایی و یا استفاده از پلیمرازی که نسبت به اثرات مواد بازدارنده حساسیت کمتری داشته باشد پیشنهاد میشود. مثلا برای  PCRگوشت یا پنیر تعدادی از پلیمرازها مانند Tfl   وrTth  بسایر راحت تر از Taq polymerase  عمل میکنند. فعالیت پلیمراز در حضور بازدارنده  با استفاده از برخی تسهیل کننده ها مانند آلبومین سرم گاوی، دی متیل سولفوکسید Tween 20 و بتایین بهبود می یابد. بعضا یک مرحله غنی سازی برای افزایش عامل بیماری زا موثر خواهد بود. برای باکتری ها، ویروس ها و پروتوزواها گیرنده ایمنی (Immunocapture) می تواند مورد استفاده قرار گیرد. فیلتراسیون نمونه های مایع برای تغلیظ عوامل بیماریزایی که از صافی 45/0میکرونی عبور میکنند (کامپلیوباکتر و اجزای ویروسی) میتواند موثر واقع شود.

باید ها و نباید ها درPCR 1-   هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کار تهیه کنید.  2-   اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همدیگر انجام گیرند.  3-   برای استفاده ازهر ماده از پیپت جدا گانه و اختصاصی استفاده کنید.  4-   از پیپت هایی که دارای plug هستند و یا از پیپت های یکبار مصرف استفاده کنید.  5-   مواد ذخیره آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت آنها راکنترل کنید.  6-   هنگام استفاده، هرلوله را spin کنید تا موادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند رسوب کنند.  7-   چندین کنترل منفی حین آزمایش Run کنید.  8-   برای انجام آزمایشهای تاییدی ازموادفریز شده استفاده کنید.  9-   هیشه DNA آمپلی فای شده را خارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید. 10-   هنگام کار با PCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید.