بدون شک مهمترین قسمت از طراحی یک “فرایند عملیات پایین دستی” مناسب به منظور تخلیص یک پروتئین، مرحلة جداسازی پروتئین موردنظر از سایر ناخالصی‌ها و آلاینده‌های موجود با استفاده از روشهای مختلف کروماتوگرافی است. بدین منظور و باتوجه به تنوع این روشها لازم است که ابتدا روشهای کروماتوگرافی از نظر مکانیزم و عملکرد مورد بررسی قرار گرفته و سپس باتوجه به ویژگی‌های این روشها مسئله اساسی استراتژی تخلیص مورد بررسی قرار گیرد.

بیش از چندین دهه است که روشهای مختلف کروماتوگرافی برای جداسازی و تخلیص مواد مختلف نظیر بیومولکولها، آب و غیره مورد استفاده قرار می گیرند. در طی این سالیان باتوجه به پیشرفت قابل ملاحظه‌ای که تکنولوژی ساخت رزین‌های کروماتوگرافی کرده است، این روشها توانسته‌اند بصورت اختصاصی‌تری در مورد شرایط مختلف جداسازی باتوجه به نوع ماده موردنظر به ایفای نقش بپردازند. کروماتوگرافی در یک تعریف کلی عبارتست از حرکت یک محلول از داخل یک بستر جامد جهت جداسازی ذرات موجود در محلول براساس ویژگی‌های مختلف فیزیکی، شیمیایی یا بیولوژیک. تقسیم‌بندی روشهای کروماتوگرافی جهت جداسازی پروتئین‌ها در”فرایند عملیات پایین دستی”، براساس مکانیزم جداسازی ذرات صورت می پذیرد, که بر اساس خواصی نظیر جاذبة یونی، جاذبة هیدروفوبیک، جاذبة بیولوژیک و خاصیت نفوذپذیری چهار روش کروماتوگرافی را در بر می‌گیرند.

برخی از این روش ها عبارتند از:

االف-کروماتوگرافی تعویض یونی (IEC) (Ion Exchange Chromatography)

ب- کروماتوگرافی با استفاده از جاذبة هیدروفوبی(Hydrophabic Interaction Chromatography) ( کروماتوگرافی با جاذبة هیدروفوبیک )

ج- کروماتوگرافی میل ترکیبی (AC) (Affinity Chromatography)

د- فیلتراسیون ژلی (GF) (Gel Filtration)

سیستم‌های کروماتوگرافی مایع
(Liquid Chromatography Systems)

جهت انجام عملیات کروماتوگرافی مایع بطور کلی از دو روش پیوسته (Continues) و بچ (batch) می‌‌توان استفاده کرد. روش کروماتوگرافی بچ روشی است که مراحل مختلف کروماتوگرافی بصورت دستی با استفاده از هم‌زن (مرحلة اعمال نمونه یا جذب) و از طریق نیروی گرانشی بدون اِعمال فشار پمپ (مرحلة تعادل سازی، شستشو و مرحلة دفع یا خروج نمونه) انجام می‌گیرد. این روش مخصوصا” در مراحل اول فرایند تخلیص در مورد ستونهای کروماتوگرافی با قدرت جذب بالا و هنگامی که میزان حجم نمونه بسیار بالا باشد, جهت کاهش زمان انجام پروسه و احتراز از کاهش فعالیت پروتئین موردنظر در زمانهای طولانی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بدیهی است پارامتر اصلی در این روش افزایش میزان جذب نمونه به رزین‌های کروماتوگرافی و انجام تخلیص بر روی حداکثر مقدار نمونة ممکن می‌باشد.

در روش کروماتوگرافی پیوسته تمامی مراحل مختلف کروماتوگرافی با استفاده از یک سیستم اعمال فشار هیدرولیک از طریق پمپ انجام می‌گیرد. جهت انجام یک چنین فرایندی می‌‌توان از سیستم‌های مختلفی نظیر
Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC) ، High Performance Liquid Chromatography  (HPLC) و یا یک سیستم معمولی متشکل از پمپ، آشکار ساز و ثبات, دارد, بعلاوة یک سیستم ایجاد گرادیان استفاده کرد. بهرحال اساس کار سیستم‌های فوق یکی بوده و در واقع جهت ایجاد یک سیستم کروماتوگرافی مایع بر روی ستونهای کروماتوگرافی مختلف (جهت انجام روشهای متفاوت) بکار می‌روند. تفاوت کار در این سیستم‌ها تفاوت در میزان فشار اعمال شده در مراحل مختلف، تفاوت در مرحلة انجام کروماتوگرافی از سلسله مراحل فرایند تخلیص از نظر استراتژی تخلیص و تفاوت در مقیاس کار (از نظر آنالیتیکال، کار صنعتی و یا نیمه صنعتی) است.این تفاوتها طبیعتا” تغییرات زیادی را از نظر جنس و نوع ستونهای کروماتوگرافی مورد استفاده, میزان فشار مقاوم ایجاد شده در سیستم، میزان تفکیک (Resolution) فرایند تخلیص و مهمتر از همه امکانات برنامه‌ریزی و کنترل فرایند توسط سیستم ایجاد خواهند کرد….. (برای حفظ اختصار ادامه مطالب حذف گردید!)

کروماتوگرافی به روش تعویض یون
Ion Exchange Chromatography

یکی از متداولترین روشهای کروماتوگرافی در فرایند تخلیص بیومولکولها به طور عام و پروتئینها بطور خاص روش کروماتوگرافی تعویض یونی است. باتوجه به اینکه در این روش از خاصیت عام پروتئین ها یعنی توانایی ایجاد جاذبة یونی با یک مادة جاذب باردار با بار مخالف برای جداسازی پروتئین مورد نظر از سایر  ناخالصی‌ها استفاده می‌شود،

انواع کروماتوگرافی تعویض یونی با توجه به مکانیزم عمل

در تمام روشهای کروماتوگرافی برای جداسازی یک پروتئین خاص، دو فاز ناهمگون وجود دارد: فاز جامد و فاز محلول. فاز جامد همان رزین کروماتوگرافی است و خواص ویژة خود را برای جداسازی ذرة مورد نظر در فاز محلول دارد. در روش کروماتوگرافی تعویض یونی فاز جامد از دو قسمت تشکیل شده است: یکی شبکة جامد (عمدتا” پلیمری یا کوپلیمری) که به‌عنوان تثبیت کننده عمل می‌کند و دیگری گروه عاملی است که وظیفة اصلی جذب یونی را بر روی ذرات باردار موجود در محلول انجام داده و خود بر روی شبکة جامد قبلا” تثبیت شده است. ساختار شبکة جامد خواصی از قبیل پایداری فیزیکی و شیمیایی رزین و میزان نفوذ پذیری ذرات برای دستیابی به گروههای عاملی را در سطح واقعی رزین تعیین می‌کند. از طرفی دیگر در تکنولوژی ساخت این شبکه‌های جامد, اندازه یا بزرگی قطعه های پلیمری وتخلخلهای آنها کنترل و تعیین می‌شود که در فاکتورهایی نظیر هزینة عملیاتی، میزان دبی جریان و فشار مقاوم تأثیر اصلی و اساسی دارند.

انواع مختلف رزین‌های تبادل یونی براساس نوع بار تثبیت شده گروه عاملی و شدت جذب تعیین می‌شود. مکانیزم تبادل یون بر این اساس استوار است که ذرات پروتئینی باتوجه به نقطة ایزوالکتریک (pI) آنها وpH محلول می‌توانند دارای برآیند بار مثبت یا برآیند بار منفی باشند و لذا می‌توانند با یونهای مثبت یا منفی قابل حرکت (یون متحرک) که قبلا” در کنار یونهای تثبیت شده دارای بار مخالف قرار گرفته‌اند، تبادل شوند.  …………………… (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب بالا

(Strong Cation Exchanger Resin)

در این نوع رزین یون تثبیت شده بر روی پایة جامد دارای بار منفی و یون متحرک دارای بار مثبت است. لذا در شرایطی که پروتئین در داخل محلول دارای بار مثبت باشد (یعنی pH محلول کمتر از نقطة ایزوالکتریک پروتئین باشد)، پروتئین  می‌تواند  براساس  میزان اختلاف نقطة pI و pH  محلول باشدت های متفاوتی جذب رزین شود. بدیهی است هرچه این اختلاف بیشتر باشد، میزان جذب پروتئین به یون تثبیت شده نیز بیشتر خواهد بود.

از معروفترین رزین‌های تبادل کاتیون، رزین S-Sepharose می‌باشد که حرف S مربوط به گروه تثبیت شدة    Methyl Sulphonate میباشد .

این گروه دارای بار منفی است و توانایی تبادل پروتئین با بار خالص مثبت را دارد. کلمة Sepharose مشخص کنندة نام تجارتی ساختار جامدی است که گروه S بر روی آن تثبیت شده و خود میتواند بر اساس اندازه دانه ها و تخلخلها دارای زیر گروههای مختلفی باشد.

رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب پائین

(Weak Cation Exchanger Resin)

مکانیزم تبادل در این نوع رزین عینا” شبیه رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب بالا است، تنها با این تفاوت که به دلیل ساختار شیمیایی یون تثبیت شده بر روی پایة جامد, دارای بار منفی ضعیف‌تری بوده و متعاقبا” قدرت جذب آن نسبت به یون متحرک یا پروتئین دارای بار مثبت ضعیف‌تر است.

رزین CM- Sepharose از معروف‌ترین رزینهای تبادل کاتیون با خاصیت تبادلی پائین است که حرف CM مخفف Carboxy Methyl   و کلمة Sepharose هم دوباره نام تجاری مربوط به ساختار جامد می‌باشد.

رزین تبادل آنیون با خاصیت جذب بالا

(Strong Anion ExchangerResin)

همانطور که از نام این نوع رزین پیداست، در این رزین یون تثبیت شده بر روی شبکة جامد دارای بار مثبت و یون متحرک پروتئین باید دارای بار منفی ‌باشد. از معروف‌ترین رزینهای تبادل آنیون با خاصیت جذب بالا می‌توان رزین Q-Sepharose را نام برد که حرف Q گروه Quaternary Ammonium   و کلمة Sepharose هم ساختار جامد را مشخص می‌کند.

رزین تبادل آینون با خاصیت جذب پائینی

(weak Anion Exchanger Resm)

تفاوت این رزین با رزین تبادل آینون با خاصیت جذب بالا بازهم در قدرت جذب گروه عاملی نسبت به یون متحرک یا پروتئین دارای بار منفی است. رزین  DEAE-Scpharose از معروفترین رزینهای تبادل آینون می‌باشد. حروف DEAE نشان دهندة گروه Diethylminoethyl  میباشد.

کروماتوگرافی تعویض یونی:

باتوجه به قدرت بالای روش کروماتوگرافی تعویض یونی برای جداسازی محصول موردنظر از ناخالصی‌های دیگر، می‌توان از این روش استفاده نمود و با اعمال یک برنامة جداسازی براساس افزایش میزان نمک و افزایش قدرت یونی، محصول مورد نظر را براحتی جداسازی و تخلیص نمود.از این روش می‌توان به عنوان مرحلة نهایی یا مرحله ای بینابینی در کنار روشهای دیگر کروماتوگرافی عمل جداسازی و تخلیص را با هدف رسیدن درجة خلوص بالا استفاده کرد. در مواردی قدرت تفکیک  این روش  آنچنان   بالاست که می‌تواند به عنوان یک فرایند تخلیص با بکارگیری تنها یک روش کروماتوگرافی انجام پذیرد.  آنچه که در این حالت حایز اهمیت است ، از میان پارامترهای اساسی کروماتوگرافی در اینجا پارامتر درجة خلوص (Purity) و میزان انتخابگری (Selectivity) اهمیت اصلی و اساسی را دارند.