غییر درهرفاکتور شیمیایی وفیزیکی PCR می‌تواند منجربه افزایش محصول، افزایش‌ حساسیت واختصاصی بودن محصول شود.البته بایدتوجه داشت که این فاکتور ها مستقل ازیکدیگرعمل‌ نمی‌کنند.

اولین نکته در انجام واکنش PCR ، رعایت نکات بهداشتی و اجتناب از آلودگی می‌باشد.  برای جلوگیری از هرگونه آلودگی لازم است که مراحل PCR در مکان های مختلف انجام شود. به طوری که محیط کار PCR به 3 قسمت تقسیم می‌شود:

1-     مرحله آماده سازی نمونه  ها، قبل از انجام PCR

2-    مرحله تنظیم واکنش PCR در دستگاه ترموسیکلر

3-     مرحله Post – PCR

در هر مرحله کار رعایت نکات زیر لازم است تا یک واکنش PCR مطلوب داشته باشیم:

الف) استفاده از تیوب های مخصوص PCR (Dnase free, RNase free) و با دیواره نازک که در هنگام قرارگرفتن در دستگاه، حرارت دستگاه را سریعاً به مخلوط واکنش منتقل کرده و در دمای بالا نیز مقاوم باشد.

ب) بهتر است که مرحله آماده سازی نمونه ها زیر هود بیولوژیک انجام شود.

ج) در تمام مراحل کار استفاده از دستکش و وسایل استریل لازم است.

د) در هر ستPCR نمونه کنترل مثبت وکنترل منفی داشته باشد. نمونه کنترل منفی حاوی تمام مواد واکنش به جز نمونه DNA یا  RNA (که در آن به جای Template از آب RNase free  استفاده شده) می‌باشد و نمونه کنترل مثبت حاوی باند مورد نظر می‌باشد.

هـ) دستگاه ترموسیکلر، بایــد درحداقل زمان و به طور دقیق، هر ســه دمای لازم در واکنش PCR  را

فراهم کند. و تغییر یک دما به دمای دیگر را باید در حداقل زمان و به دقت فراوان انجام دهد. …………………… (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

ترکیبات واکنش PCR

الگو:

کیفیت نمونه مورد استفاده در واکنش PCR بسیار مهم می‌باشد. به طوری که اگر در نمونه DNA مقدار زیادی RNA وجود داشته باشد، با یون ⁺²Mg موجود در مخلوط،  واکنش داده و منجر به کاهش محصول PCR می‌شود. مقدار نمونه DNA در واکنش نیز، در واکنش PCR تأثیر مستقیمی دارد. به طوری که مقدار استاندارد هر نمونه DNA در واکنش PCR به صورت زیر می‌باشد:

الف)حداکثر مقدار DNA ژنومی انسان در واکنش PCR ، بیشتر از 500  نانوگرم می‌باشد.

ب) 10- 1نانوگرم از DNA باکتریایی

ج)1- 1/0  نانوگرم از DNA  پلاسمیدی

پرایمر Primer :

در اغلب کاربرد های PCR ، غلظت و توالی پرایمر در واکنش، نکته مهمی در موفقیت  واکنش PCR  محسوب می‌شود. برای طراحی یک پرایمر مناسب چندین برنامه نرم افزاری در دسترس می‌باشد.

خصوصیات کلی یک پرایمر که در طراحی آن باید مدنظر قرارگیرد، به صورت زیر می‌باشد:

1-    طول یک پرایمر 24-18 جفت باز باشد.

2-     یک توالی پرایمر ساختار ثانویه داخلی نداشته باشد.

3-     یک توالی پرایمر شامل 60-40%  باز G/C باشد.

4-     در طول توالی پرایمر یک توزیع مناسب در نواحی A/T-rich وrich  – G/C باشد.

5-     انتهای 3’ یک پرایمر مکمل پرایمر دیگر نباشد (primer – dimer تشکیل نشود).

6-   داشتن یک Tm (دمای ذوب) که قادربه تحمل دمای اتصال 65- 55  درجه سانتی گراد (حداکثر  65-62 درجه سانتی گراد) باشد (به طور کلی، یک دمای اتصال  مناسب، اغلب بیشتر از Tm یک پرایمر می‌باشد).

غلظت بهینه یک پرایمر معمولاً 1/0- 6/0 میکرو مولار می‌باشد. غلظت بالای پرایمر ممکن است منجر به کاهش اختصاصی بودن اتصال پرایمر به الگو شود و درغلظت پایین پرایمر نیز ممکن است قبل از کامل شدن واکنش PCR ، تمام شده و در نتیجه منجر به کاهش میزان محصول و کیفیت  واکنش PCR می‌شود. برای ایجاد جایگاه محدود کننده  در یک پرایمر می‌توان چند جفت باز  هیبرید نشده با نمونه الگو را به انتهای 5’ پرایمر اضافه کرد. …………………… (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

انتخاب DNA Polymerase :

انتخاب DNA پلیمراز درانجام یک واکنش PCR موفق بسیارمهم است. دراغلب واکنش  های PCR ، آنزیم Taq DNA به عنوان آنزیم استاندارد PCR محسوب می‌شود. اما این آنزیم یک سری محدودیت هایی نیز دارد که برای غلبه بر این محدودیت ها ازآنزیم های دیگری می‌توان استفاده کرد.

– به عنوان مثال برای افزایش کارآیی واکنش  PCR می‌توان از آنزیم Pwo DNA پلیمراز یا آنزیم Blend استفاده کرد.

– به منظور بهبود کیفیت محصول PCR  از سیستم Expand High fidelity PCR  استفاده می‌شود.

– بـــرای تکثیــر توالی های غنی از (GC-rich) GC ، از سیستم PCR – GC – Rich  یا از سیستم  Expand long template PCR  استفاده  شود.

در اکثر واکنش  های PCR،  غلظت بهینه آنزیم  DNA پلیمراز مقاوم  به  دما  بین  5 /2 – 5/0

reaction volum. 50 μl /  Unitمی‌باشد. افزایش غلظت آنزیم دربعضی موارد منجربه کاهش اختصاصی بودن واکنش‌می‌شود.

غلظت MgCl₂ :

Mg²⁺ در ترکیب با dNTP یک کمپلکس محلول تشکیل داده و ایجاد یک سوبسترایی که  قادر به شناسایی آنزیم می‌باشد، می کند. غلظت Mg²⁺ آزاد به غلظت ترکیباتی که به این یون متصل می‌شود (همانند dNTP و پیروفسفات آزاد و EDTA)  وابسته  است.

برای رسیدن به یک نتیجه مطلوب در واکنش PCR ، بهتر است که غلظت بهینه MgCl₂ به صورت تجربی و با آزمایشات مختلف به دست آید. اما معمولاً غلظت انتخابی MgCl₂ در محدوده 1 تا 5 میکرومولار می‌باشد و به طور معمول از غلظت 5/1 میکرومولار MgCl₂ (در حضور dNTP با غلظت 200 میکرومولار از هر کدام)  استفاده می‌شود. Mg²⁺ در فعالیت آنزیم تأثیر گذاشته و میزان Tm ، DNA دو رشته ای را افزایش می دهد. افزایش Mg²⁺ در واکنش منجر به افزایش اتصالات غیراختصاصی پرایمر و افزایش واکنش  های چرخه ای غیراختصاصی می‌شود.

غلظت dNTPs :

به منظور کاهش اشتبا هات آنزیم بهتر است از محلول‌ های یکنواختی از تمام 4 نوع         dNTPs استفاده شود.استفاده ازمخلوط های ناهمگن s dNTP منجر به کاهش کارآیی آنزیم Taq پلیمراز می‌شود. افـزایش در میزان dNTPs  منجر به کاهش یون های Mg²⁺ آزاد شده و در نتیجه  در فعالیت  آنزیم تداخل ایجاد کرده و اتصال اختصاصی پرایمر را کاهش می دهد. غلظت بهینه  dNTPs در واکنش PCR معمولاً بین 500-  50  میکرومولار (از هر dNTPs)  می‌باشد.

pH واکنش:

pH بافری واکنش توسط آنزیم  های DNA پلیمراز مقاوم به حرارت (9-3/ 8 pH)  تأمین می‌شود. با وجود این در بعضی سیستم‌ ها، افزایش pH  منجر به پایداری DNA الگو و در نتیجه   افزایش محصول می‌شود.

در بعضی از موارد، اضافه کردن ترکیبات زیر منجر به افزایش کارآیی و اختصاصی بودن واکنش PCR می‌شود:

1-    (2-5/0 میکرولیتر) Betaine

2-     سرم آلبومین مرغی (BSA) (100نانوگرم /50 میکرولیتر)

3-     شوینده ها Detergents

4- دی متیل سولفوکسید DMSO (v/v ) (10-2%)

5- ژلاتین

6- گلیسرول    (V  /V ) (% 5-1)

7 – پیروفسفات ( unit / reaetion 1 /0- 001/0)

8- spermidin

9- T4 Gene 32 Protein