آگروباكتريوم:

نوعی باكتري خاكزي گرم منفي است كه باعث بيماري گال تاجی در گياهان ميشود.

A.tumefaciens: آگروباكتريوم توم فاسينس- تشكيل گال طوقه

A. rhizogenes: آگروباكتريوم ريزوژنز- بيماري ريشه هاي مويي

چگونه آگروباكتريوم باعث بروز بيماري ميشود؟

تشابه ظاهري بين گال هاي توليد شده توسط آگروباكتريوم و تومورهاي حيوانات توجه دانشمندان را در سالهاي 1960 و 1970 به خود جلب كرد به اين طريق كه گال ها به مانند سرطان ميمانند؟ در نهايت دانشمندان به اين نتيجه رسيدند كه مگاپلاسميد براي بوجود آمدن بيماري ضروري است. مگاپلاسميد آگروباكتريوم تومفاسينس در نهايت به عنوان پلاسميد (القاكننده تومور) تعيين شد. به صورت مشابه مگاپلاسميد آگروباكتريوم ريزوژنز به عنوان پلاسميد شناخته ميشود. در ان زمان اين طور فرض شد كه اين پلاسميدها ممكن است به صورت فعال وارد سلولهاي ميزبان شوند اما فناوري در ان زمان به اندازه كافي پيشرفته نبود تا قطعات كوچك در ژنوم بزرگ گياه را تشخيص دهد. با بوجود آمدن تکینیک DNA نوترکیب (به عنوان مثال آنزيمهاي برشي لكه گزاري يا بلات كردن) امكان اينكه صحت فرضيه انتقال DNA بررسي شود امكان پذير شد. ثابت شده است كه تشكيل گال بستگي به فعاليت تعداد محدودي از ژنها (آنكوژنها) دارد كه برروي پلاسميد قرار دارند. اين ژنها همچنين باعث سنتز تركيبات نيتروژني غير معمول (اپين ها) در بافت گال ميشوند.

محل و چگونگي بوجود آمدن گال

آگروباكتريوم از محل زخم تازه وارد گياه ميزبان ميشود. محل زخم دو اثر مهم در كلن شدن آگروباكتريوم دارد:

1- ترشح متابوليتهاي فنولي كه آگروباكتريوم آنرا تشخيص ميدهد و با فعال كردن ژنهاي لازم براي انتقال DNA عكس العمل نشان ميدهد 2- فضايي براي فعاليت تقسيم سلولي بوجود مياورد و در همين حال محل زخم ترميم ميشود.

القاكننده هاي Vir فنولي محصول متابوليسم فنل پروپانويد هستند به نظر ميرسد كه اينها با مولكولهايي كه در استحكام مارپيچ پلي ساكاريد ديواره سلولي نقش دارند مرتبط باشند( به عنوان مثال انتقال دهنده هاي فنلي و ليگنين هاي پليمري).

القاي Vir همچنين با حضور قندهاي ساده و PH اسيدي كه هر دو آنها در اثر بروز زخم در گياه بوجود ميايد تشديد ميشود.

آگروباكتريوم بايد به صورت فيزيكي به ديواده سلولي متصل شود تا بتواند T-DNA خود را به گياه انتقال دهد. وقتي تماس اوليه بر قرار شد باكتري ها شبكه در هم پيچيده اي از فيبريل هاي سلولزي (بتا- 1-4 گلوكان) را بوجود مياورند كه كمك ميكند تا سلولها به ديواره سلولهاي گياهي متصل شوند.

جابجایی DNA:

بطورمعمول شامل يك پلاسميد بزرگ به اضافه كروموزمهاي آن ميباشد. فعاليتهاي متفاوت بيولوژيكي آنها توسط ژنهايي كه روي پلاسميد هستند ديكته ميشود.

Ti plasmid :

3 منطقه مهم براي جابحايي DNA و تشكيل غده وجود دارد: T-DNA، T-DNA Borders و منطقه Vir.

T-DNA:

دارای ژنهاي كد كننده براي بيوسنتز فيتوهورمونها(اكسين و سيتوكينين) و ژنهاي كد كننده براي سنتز اپين است که اين ژنها فقط در گياه رونويسي ميشوند.

Opin ها قندها و پروتئین های نادری هستند که T-DNA، گیاه را مجبور به ساختن آنها می کند. این مواد بعنوان منبع غذایی از کربن و نیتروژن مورد استفاده باکتری قرار می گیرند. از مهمترین انواع اپاین ها، Nopalin ها و Octopin ها هستند:

nopaline = arginine + alpha-ketoglutarate

octopine = arginine + pyruvate

mannopine = glutamine + mannose

agrocinopine A = sucrose + arabinose

:T-DNA borders

24-25 جفت باز با ترتيب تكراري در هر دو طرف T-DNAقرار دارند که به نظر مي رسد فقط طرف راست(Right Border) مهم باشد.

Vir region:

اين منطقه 35 كيلو بازي، شامل 6-9 واحد قابل رونويسي است.(VirA, B, C, D, E, F, G, H, J)

براي تشكيل گال چهار لوكوس وير قابل اهميت است(A, B, D and G) .

بعضي از محصول فعاليت ژنهاي وير در داخل سلول باكتري است ولي بعضي ديگر منتقل ميشوند و در داخل سلول ميزبان عمل ميكنند.

بيشتر ژنهاي وير در غياب سلولهاي ميزبان خاموش هستند ولی VirA و VirG به مقدار کم رونویسی می شوند. VirA و VirG به صورت يك سيستم كنترل كننده سلسله مراتب، بقيه ژنهاي وير را كنترل ميكنند.

VirA با غشائ داخلي باكتري متصل گرديده و با ژن كروموزومي ChvE یک کمپلکس تشکیل می دهد. پيوند يك ملكول فنول خاص كه با Vir A كمپلكس تشكيل ميدهد باعث فعاليت پروتئين كيناز و فسفریليزاسیون ميشود.

محصولات ژن (VirD1 and VirD2) virD به توالي سمت راست مرزي متصل شده و يك شكاف در انتهاي T-DNA بوجود مياورند. اين فعالت با محصولات ژن VirC که به توالی های مجاور متصل می شوند تشدید می شود.

پروتئین VirD2 با پیوندهای کووالانسی به انتهای رشته T، در طی مراحل انتقال متصل می ماند.

پروتئین VirE2 یک پروتئین متصل به DNA تک رشته ای است که چندین کپی از آن رشته DNA را احاطه می کنند. VirE2 نیز به میزبان منتقل می شود. محصولات ژن VirB یک ساختار ترشحی نوع 4 را تشکیل میدهد که در هدایت ساختار نقش دارد.

ساير نواحي پلاسميد Tiنيز نقشهاي مهمي ايفا ميكنند:

ناحيه اتصال – توانايي اگروباكتريوم را براي تبادل پلاسميدها با ديگر سلولهاي باكتريايي كنترل ميكند كه با سيستم انتقال T-DNAمشابه است.

ناحيه كاتابوليسم اپين – پروتئينهايي را كد ميكند كه براي وارد كردن و استفاده كردن ازكلاس مشابه اپينهايي كه سنتز آنها بوسيلهT-DNA انجام می شود لازم است.

ناحيه همانند سازي پلاسميد – اجازه ميدهد تا آگروباكتريوم پلاسميدTi را طی تقسیم سلولی نگه دارد.انتقال T-DNA و الحاق آن

مكانيزم دقيق انتقالT-DNA نامشخص است. اين مكانيزم به انرژي نياز دارد و معمولا طي 2-4 ساعت بعد از تماس كامل مي شود.

نقش دارند: T-DNAژنهاي گياهي كه در الحاق

به نظر ميرسد كه بسياري از محصولات ژنهاي گياهي براي انتقال T-DNA به درون ژنوم گياهي لازم هستند. اين محصولات داراي نقش مستقيم در حمايت از الحاق T-DNA نيستند بلكه بيشتر رشد و نگهداري سلول گياهي را حمايت مي كنند.

ژنهايT-DNA و تشكيل تومور

T-DNA حاصل از نژادهاي وحشي اگروباكتريوم دو نوع عملكرد دارد: توليد هورمونهاي گياهي و سنتز اپين. ژنهایT-DNA داراي پروموترها وكدونهايي هستند كه به آنها اجازه ميدهد تا بصورت قابل توجهي در سلولهاي گياهي ونه در سلولهاي باكتري رونويسي شوند.

دامنه ميزباني

A-tumefaciens داراي دامنه ميزباني وسيعي در خانواده دو لپه ها بوده و بازدانگان ميزبان خوبي براي آن نيستند. به نظر ميرسد كه اين به علت عدم توانايي در توليد مواد القا كننده فنولي باشد. در موارد ديگرهم ممكن است ناسازگاري با ساير فاكتورهاي موجود در گياه ميزبان به صورت بيوشيميايي بروز كند. در بعضي موارد با استفاده از هم كشتي اگروباكتريوم با بافتهاي اختصاصي (به عنوان مثال برگچه هاي لپه اي در براسيكا) توانسته اند بر اين ناسازگاريها غلبه كنند.

در غياب فعاليت انكوژنها چگونه ميتوان سلولهايي كه داراي قطعاتي از T-DNA هستند را شناسايي كرد؟

نشانگرهاي قابل انتخاب:

تنها به بخش كوچكي از جمعيت سلولهاي ميزبان انتقال داده مي شوند.

بايد شرايطي را فراهم آورد تا سلولهايحاوی ژن نشانگرزنده مانده و سلولهايي كه به آنها ژن نشانگر انتقال نیافته، بميرند يا رشد نكنند(= فشار انتخاب).

اولين عملكردهاي نشانگر قابل انتخاب در ميكروبيولوژي بود.

ژنهاي مقاوم به آنتي بيوتيكها

بعضي آنتي بيوتيكها مانع رشد باكتريها و سلولهاي گياهي ميشوند:

kanamycin و hygromycin

بعضي از ژنهاي باكتريايي، پروتئين هايي كد ميكنند كه باعث تخريب ساختمان آنتي بيوتيك شده و آنرا غير فعال می سازد( به عنوان مثال نئومايسين فسفوترانسفراز nptII)

در اختيار داشتن يك آنزيم تخريب كننده آنتي بيوتيك، مزيت انتخاب شوندگي را به سلولهاي گياهي ميدهد، يعني nptII يك ژن نشانگر قابل انتخاب است.

ژنهاي نشانگر قابل انتخاب بايد در هسته سلولهاي گياهي به صورت كارايي رونويسي شوند.

از پروموترهاي مشهور براي اين هدفnos (ژن نوپالين سنتتاز) و CaMV35S (از ويروس موزائيك كلم)هستند.

ژن مورد علاقه(هدف)

هر ژني كه از قطعه T-DNA بيان مي شود بايد:

يك پروموتر و یک ترمیناتور مناسب داشته باشد.

داراي يك توالي مناسب شروع كننده باشد.

داراي كدونهاي قابل استفاده گياهي باشد

ژنهاي چند تايي ميتوانند به صورت همزمان از يك سازه(كانستركت) بيان شوند.

اما محدوديت هايي وجود دارد كه عبارتند از:

اندازه DNA (بزرگتر = الحاق ناكاراتر) و اندازه ناقل كلن كننده ( بزرگتر = كنترل و دستكاري سخت تر)

Explant Co-cultivation

يكي از گسترده ترين روشهايي كه استفاده ميشود همكشتي ريز نمونه است: به سادگي ريزنمونه را در محلول كشت اگروباكتريوم كه داراي پلاسميدTi تغيير يافته است فرو مي برند. اجازه داده مي شود كه مراحل آلودگي به صورت كامل انجام گيرد. سپس صبر مي شود تا باقيمانده اگروباكتريوم توسط آنتي بيوتيكها از بين رفته و از محیط حذف شود.

در اين روش به سازگاري بين اگروباكتريوم و گياه ميزبان اطمينان ميشود.

انتخاب بافت، pH، دما، سويه اگروباكتريوم و القا كننده خارجي بايد براي هر سيستمي بهينه شود.

زماني كه انتقال ژن بوسیله اگروباكتريوم میسر نباشد(مانند گیاهان تک لپه)، از روش دوم انتقال مستقيم DNA به سلول هدف استفاده ميشود: biolistic transformation    

سيستمهاي جايگزين نشانگرهاي انتخابگر

مقاومت به آنتي بيوتيكهایkan, hyg

مقاومت به علف كش Round-up, Basta, Glean

فسفومانوز ايزومراز (PMI)

مراحل انتقال ژن توسط آگروباكتريوم:

ساختconstract

comptent كردن آگروباكتريوم

انتقال DNA به آگروباكتريوم

رشد آگروباكتريوم

co-coltivation

از بين بردن باكتري با آنتي بيوتيكهاي مشخص

رشد احتمالي گياهچه ها درمحيطهاي انتخابي

وکتورهای دوگانه(Binary Vectors)

در اصلاح نباتات، بدلیل دشوار بودن دست ورزی ژنتیکی پلاسمیدها در درون آگروباکتریوم، از باکتری ای کولای نیز در انتقال ژن استفاده می شود، چرا که بدلیل تعداد بالای کپی های پلاسمید در درون ای کولای، دست ورزی پلاسمیدها سهل تر از آگروباکتریوم خواهد بود. همچنین کشف اینکه نیاز به حضور همزمان ژنهای بیماریزا(vir) و T-DNA در درون یک پلاسمید نیست، پژوهشگران را به استفاده از ناقلهای دوگانه ترغیب کرد. دو نوع پلاسمید خواهیم داشت: 1- پلاسمید خلع سلاح شده (Disarmed Ti plasmid ) که فاقد ژن بیماریزا بوده اما حاوی ژن مورد نظر جهت انتقال و همچنین ژنهای مارکر و دو ناحیه Ori(Origin Replication) برای هر دو نوع باکتری ای کولای و آگروباکتریوم می باشد. 2-پلاسمید کمکی(Helper vector) که حاوی ژنهای بیماریزا بوده و تنها Ori متعلق به آگروباکتریوم را در برگرفته و فاقد توالی T-DNA می باشد.

روال کار: پس از وارد سازی ژن هدف به پلاسمید خلع سلاح شده، این پلاسمید بدرون ای کولای انتقال می یابد و سپس بنابر تظاهر ژنهای مارکر(معمولا مقاوم به آنتی بیوتیک)، باکتریهای حاوی پلاسمید نوترکیب شناسایی شده و در مرحله بعد پلاسمید خلع سلاح شده، از طریق الکتروپوریشن(جریان الکتریسته) یا ایجاد تقاطع(Conjugation) به آگروباکتریوم حاوی پلاسمید کمکی انتقال می یابد. سپس با آلوده سازی بافت کالوس گیاهی حاصل از X-pkant توسط آگروباکتریوم حاوی هر دو نوع پلاسمید، امکان انتقال ژن هدف به گیاه فراهم می شود. گفتنی است که ژنهای بیماریزای حاضر در پلاسمید کمکی، پروتئین های لازم جهت انتقال ژن(DNA) هدف بدرون گیاه را فراهم می آورند. در مرحله پایانی گیاهچه های تراریخته مقاوم به آنتی بیوتیک شناسایی و باززایی می شوند تا بتوان گیاه کامل حاوی ژن مورد نظر را بدست آورد.

مراحل انتقال ژن توسط تفنگ ژنی

ساخت constract

انتقال به E. Coli

رشد باكتري

استخراج(پلاسميد) DNA

رسوب دادن DNA بر روي ذرات طلا

تهيه ريز نمونه و استقرار آنها روي محيط
شليك ذرات طلا و DNA بر روي ريزنمونه آماده شده.