استخراج DNA ژنومی گیاه

مقدمه:

استخراج DNA مطلوب از گياه براي بررسي هاي ژنتيكي از اهميت ويژه اي برخوردار است.

در تمامي روش هاي مبتني بر PCR براي اهداف مختلف، استخراج DNA گام اول و مهم مي باشد. هر چه قدر روش استخراج DNA سريع، مقرون به صرفه وDNA حاصل داراي كيفيت بيشتري باشد، براي انجام PCR مناسب تر است.

به طور کلی میشه روش های استخراج رو دو دسته در نظر گرفت:

1- روش هایی که در اون همه ی اجزای شیره ی سلولی تجزیه میشه و فقط DNA مورد نظر ما باقی می مونه (این روش بیشتر در سلول هایی که محتوای کربوهیدرات و چربی کمی دارن مورد استفاده قرار میگیره).

2- روش هایی که در اون دقیقا DNA مورد نظر ما از بقیه ی اجزای شیره ی سلولی جدا میشه.

در هر دو روش اول باید سلول تخریب بشه:

در رابطه با سلول های باکتریایی میشه از آنزیم لیزوزیم برای تخریب دیواره ی سلولی استفاده کرد.

در مورد سلول های جانوری دترجنتهايي DETERGENTS مثل SDS برای این کار مناسب هستند که غشای سلولی رو تخریب می کنند.

اما در سلول های گیاهی که دیواره ی سلولزی محکمی وجود داره روش های پیچیده تری از جملهانجماد مورد استفاده قرار میگیره.

اما اصولی که در شیوه ی اول رعایت میشه:

بعد از تهیه ی شیره ی سلولی اول ازسانتریفیوژاستفاده میشه که طی اون تمام اجزای سنگین سلولی مثلا اندامک ها رسوب می کنند. بعد محلول رویی که دارای DNA مورد نظر ماست جدا میشه و پروتئین هاش بافنل رسوب می کنن (فنل باعث ایجاد دو فاز مجزا میشه و پروتئین ها در حد فاصل دو فاز رسوب می کنن) بعدش فاز آبی دارای نوکلئیک اسیدها جدا شده و این بار نوبت RNA هاست که محلول حاویDNA رو ترک کنند و این کار با کمکآنزیم ریبونوکلئازصورت می گیره حالا میشود DNA سالم موجود در محلول رو به کمک اتانول رسوب داد و استخراج تموم می شود.

و اما در روش دوم مثلا از کروماتوگرافی تعویض یونی استفاده میشه که طی اون بستر ما دارای بار مثبته و مولکول های DNA، RNA و پروتئین های دارای بار منفی بهش می چسبند و بقیه ی مواد از ستون خارج میشند. حالا نوبت می رسه به جدا کردن این مواد از هم که به کمک که محلول های با غلظت نمک متفاوت و در نتیجه قدرت یونی متفاوت صورت می گیرد (همونطور که میدونیم هرچه قدرت یونی بالاتر بره مولکول هایی که محکمتر با بستر میان کنش دارن جدا میشن) اول از محلول های با قدرت کمتر که باعث جدا شدن پروتئین ها میشه و بعد با اضافه شدن قدر یونی به ترتیب RNA و در نهایت DNA جدا میشه.

روشهاي مختلفي براي استخراجDNAاز ميوه ها و پياز ارائه شده اند كه دلايل زير براي اعمالي كه در اين روشهاي مختلف انجام مي شود ذكر مي گردد:

1-چليت كردن كاتيون هاي دو ظرفيتي مانند Ca²⁺, Mg²⁺ به وسيله نمكبراي متوقف كردن اعمال آنزيم تجزيه كنندهDNA (دي ان آزDNase-) همچنين نمك مي تواند انتهاهاي فسفات DNA را به هم نزديك كند

و در نتيجه رسوب آن را آسانتر نمايد.

2-خرد كردن سلولها به وسيله رنده كردن

3- ازبين بردن ليپيدهاي غشاء به وسيله اضافه كردن دترجنت و در نتيجه شكسته شدن غشاء

4-از بين بردن پروتئين هاي سلول و هيستون ها ي متصل بهDNA به وسيله اضافه كردن يك پروتئاز و يا ته نشين كردن آنها با استات سديم يا آمونيوم و يا نمك آشپزخانه

5-رسوب DNA در اتانول يا ايزوپروپانول سرد زيرا DNA در الكل نامحلول است اما در آب محلول است به هم مي چسبند و اين مرحله همچنين نمك را خارج مي كند.

6-حرارت دادن(50 تا 60 درجه سانتي گراد) نه تنها به شكستن سلولها كمك مي كند بلكه باعث غير فعال شدن آنزيم هايDNase نيز مي شود البته حرارت دادن اگر زياد طول بكشد خودDNA را نيزتجزيه مي كند. به همين علت در روشهائي كه از حرارت استفاده مي شود بايستي حد اكثر 12 دقيقه عصاره را در حمام آب گرم قرار داد و سپس بلافاصله جهت جلوگيري از انهدامDNA عصاره را در حمام آب سرد-يخ به مدت15 -5 دقيقه قرار داد.

7-كج نگاه داشتن لوله و سپس اضافه كردن الكل سرد مانع از مخلوط شدن عصاره و الكل ميگرددو در نتيجه دو فاز تشكيل مي گردد.

شرح آزمایش :

1 )آماده سازی محلول =مقدار 1.5 گرم نمك وcc 120 آب مقطر را در يك بشر cc 100ریختیم.آنها را مخلوط كردیم تا نمك كاملا ً حل شود.5 گرم جوش شیرین و همچنین 5 ml صابون مایع اضافه کردیم .

2 ) نصف پیاز را بریده و در هاون کوبیدیم.

3 ) 10 mlعصاره پیاز + 20 mlمحلول شماره 1 ← 30 Min روی استیرر

4 ) انتقال به لوله آزمایش ← 5min  در یخچال

5 ) محلول را از کاغذ صافی رد کردیم

6 ) اضافه کردن الکل سرد

7 ) خارج کردن DNA  با استفاده از یله شیشه ای

8 ) انتقال به میکرتیوپ

9 ) سانتریفوژ

10) بافر TB

برای حذف این مراحل طولانی و برای برای راحتر کردن کار می توان از کیت های استخراج DNA استفاده کرد که باعث می شود سرعت عمل کار بالا بره که مزایای کیت های استخراج DNA عبارتند از:

ويژگی ها و مزايای کیت استخراج dna

–   استخراج سريع و كارآمد از انواع نمونه ها
– کاربری ساده و سريع
–  گرفتن نتيجه در زمان کوتاه: کمتر از 30 دقيقه
–   قابليت نگهداری در شرايط دمای محيط
–   به حداقل رساندن آسيب های وارده به اسيدهای نوکلئيک در حين عمل استخراج
–   حذف مهارکننده هاي آنزيمی مزاحم PCR
–   عدم نياز به حلال های آلی مضر مثل فنل
–   عدم وجود مراحل رسوب دهی
–   درجۀ تخليص بالا A260/A280>1.8

بجز موارد عنوان شده این کیت این قابلیت را دارد که بصورت موثر بتوانند محتوای DNA انواع موجودات را استخراج کرد. این کیت استخراج DNA از3 نوع گیاه مختلف نمایش داده شده است. نقطه جالب و مورد توجه این است که این نوع بافر ابدایی توان استخراج DNA را در عرض 20-25 دقیقه داراست که میتوان DNA استخراج شده را بصورت مستقیم جهت انجام pcr استفاده کرد.