(Reverse Transcriptase-PCR)

‏ اين روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن ‏RNA‏ است. اولين مرحله در اين روش تبديل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏ DNAاي كه مكمل توالي‌هاي ‏mRNA‏ است) توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس می باشد (RT). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضي از ويروس‌ها مانند ويروس هپاتيت ‏B‏ هرگز به شكل ‏DNA‏ مابين در اثر آنزيم نسخه‌بردار معكوس درنمي‌آيد. آنزيم نسخه‌بردار معكوس (‏RT‏) در اين روش از  “‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏” و “‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ ” به‌دست آمد. 
كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام “ترموس ترموفيلوس” يك ‏DNA‏ پليمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود يافت كه در حضور يون ‏Mn⁺²‎‏ داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتي گراد توسط اين آنزيم از روي ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته مي‌شود و سپس ‏Mn⁺²‎‏ اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسید (‏EGTA‏) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از ‏DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.‏

بازدارنده و فعال کننده ی PCR:

فعال کننده:

بازده و ويژگي PCR بوسيله فاكتورهاي مختلفي تحت تأثير قرار مي‏گيرد. كيفيت DNA الگو، طراحي پرايمرها و شرايط PCR مانند غلظت MgCl₂،DNA پليمراز و شرايط بافري، همه و همه در بازده و ويژگي تأثير گذار هستند.

برخي از عوامل مهم:

–   پروفايل حرارتي PCR ) چسبيدن پرايمر، پليمريزاسيون، دناتوراسيون، زمان افزايش و كاهش حرارتي ، و تعداد سيكل ها)

–        غلظت يون منيزيوم

–        طراحي پرايمر و غلظت آن

–        كيفيت الگو و غلظت آن

–        بافر PCR

–        غلظت dNTP

–        اضافه كردن ترغيب كننده‏هاي PCR

–        حذر از مواد بازدارنده PCR

–        PCR ثانوي با پرايمرهاي نستد

–        PCR با شروع داغ

بازدارنده:

منابع بالقوه آلودگي زيادي قبل از انجام PCR وجود دارد كـه در ايـن تكنيك حسـاس خـود را نمايـان مي‏نمايد. براي مثال اگر نمونه‏هاي كلينيكي به كار رود روش هاي مناسب جهت جمع آوري و نگهداري نمونه بايد اتخاذ گردد. منشاء DNA آلوده كننده مي‏تواند سلولهاي پوست يا موي افراد، سطوح آزمايشگاه و بسياري چيزهاي ديگر باشد. آلودگيهاي قابل انتقال از طريق هوا يكي ديگر از علت هاي آلودگي نمونه‏ها است. واكنشگرها و اجزاء مورد استفاده در PCR يا مراحلي كه در استخراج و تهيه DNA يا RNA الگوي نمونه‏ها به كار مي‏رود از ديگر منابع بالقوه DNA خارجي است. براي مثال، در واكنش PCR ، اجزاء بافر، ژلاتين، پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي، dNTPها و حتي DNA پليمراز ممكن است آلوده گردد.

همچنين ممكن است با مشكلات ديگري از ناحيه مواد مورد استفاده در استخراج يا تهيه نمونه قبل از PCR )بطور مثال آنزيم نسخه بردار معكوس،T4-DNA ليگاز، آنزيم‏هاي محدود كننده، پروتئيناز (K مواجه شويم. نكته مهم اين است كه تمام مواد مورد استفاده در PCR بايدPCR grade  باشند يعني آلودگي با DNA نداشته باشند.

آلودگی هاي منفرد به سادگي قابل كنترل نيستند با اين حال كنترل هاي مختلف در هر مرحله از كار، بخصوص اگر PCR جنبه تشخيص دارد بايد انجام شود. كنترل هاي منفي جهت آزمايش واكنشگرهاي PCR از جهت آلودگي با DNA )بطور مثال DNA ژنوميك، DNA عوامل عفوني يا آلودگي هاي ناشي از محصول قبلي (PCR بايد طراحي شود. كنترلهاي مثبت با نمونه‏هاي حاوي DNA مثبت، از نظر ارزيابي بازده و ويژگي PCRاهميت حياتي دارد.

برخي از عوامل مهم :

– نمونه‏هاي بيولوژيكي )براي مثال از بيماران، حيوانات و …)

– روش هاي جمع آوري نمونه

– گروه كاري در آزمايشگاه

– محيط آزمايشگاه / تهويه مطبوع

– نيتروژن مايع / يخ

– هوموژنايزر بافت

– پي پت ها / سرسمپلرها

– لوله‏هاي واكنش/ لوازم شيشه‏اي

– واكنشگرها

– محصولات بيولوژيكي يا نوتركيب (مثلا ژلاتين، آلبومين سرم گاو (BSA)، آنزيم‏هاي محدود كننده)

–  هود

– سانتريفوژ/ لوله‏هاي سانتريفوژ

– ميكروتوم

– ترموسايكلر

– ترانس ايلومينيتور UV

– وسايل الكتروفورز

– آلودگي بعد از PCR ناشي از جابجايي محصولات PCR