بررسی وجود DNA با استفاده از روش نانودراپ و اسپکتوفتومتری
نانودراپ
یکی از پیشرفتهایی که در زمینه دستگاههای اسپکتوفتومتری صورت گرفته، ساخت نانو دراپ می باشد. این دستگاه سرعت پردازش بالایی دارد و توانایی اندازه گیری طیف مرئی و UV را دارد و برای اندازه گیری، فقط به 1 میکرولیتر از نمونه مورد نیاز است. بعلاوه در اندازه گیری به این روش به وسایل دیگری به جزء سر میکروپیپت نیازی نیست . نانودراپ همچنین برای اندازه گیری غلظت پروتئین و رنگهای فلورسنت بکار می رود.
اسپکتروفتومتر نانودراپ، NanoDropTM این دستگاه بدون نیاز به کووت و تنها با استفاده از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موجهای موجود در طیف مورد نظر را با دقت 1 نانومتر، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند. با توجه به سرعت بسیار بالای دستگاه و میزان کم نمونه مصرفی، کاربران این دستگاه قادر خواهند بود ضمن صرفهجویی در زمان و هزینه، بسیاری از آزمایشات ژنومیکس، پروتئومیکس و بیوشیمی را کنترل کیفی و بهینه نمایند.
ویژگیهای دستگاه:
قابلیت اندازه گیری غلظت و کیفیت اسیدهای نوکلئیک از 2ng/ml تا 3700 ng/ml بدون نیاز به رقیق سازی نمونه
محدوده طول موج: 190 تا 840 nm – دقت جذب نوری 003/0 abs
اندازه گیری غلظت پروتئینها – اندازه گیری دانسیته سلول ها
اندازه گیری و تعیین غلظت دی. ان. اِی و آر. ان. اِی و اولیگونوکلئوتیدها در حجم یک میکرولیتر بدون احتیاج به رقیق سازی نمونه
اندازه گیری غلظت پروتئینهای خالص بصورت مستقیم
اندازه گیری غیرمستقیم غلظت میکس پروتئینی با رسم منحنی استاندارد
قابلیت ذخیره سازی اتوماتیک کلیه اندازه گیری ها به تفیک جذب در هر نانومتر
دارای سیستم مونیتورینگ و عیبیابی جهت آگاهی از کیفیت فیزیکی اجزاء دستگاه
تعیین خلوص اسید نوکلئیک
جذب در طول موج 260 نانومتر به تنهایی اطلاعات کمی را در زمینه خلوص و کیفیت نمونه فراهم می کند. در صورت وجود آلودگی پروتئینی، آلودگی به حلال های آلی و نمک های و کربوهیدراتها، میزان جذب به طور معنی داری تغییر می کند. بنابراین محاسبه نسبت جذب 260 به 280 و نسبت 260 به 230 تعیین کننده خلوص اسیدهای نوکلئیک استخراجی می باشد.
- برای نمونه های آر. ان. اِی نسبت 260به 280 برابر 1±2 و برای نمونه ها دی. ان. اِی نسبت 260 به 280 برابر 1± 8/1 قابل قبول است. غلظت 260 به 280 پائینتر از 8/1 عموماً نشاندهنده آلودگی پروتئین در طی مراحل استخراج می باشد. یکی از مشکلات در استخراج آر. ان. اِی و دی. ان. اِی حذف ناکامل پروتئینها از عصاره سلولی می باشد. پروتئین جذب در طول موج 280 را افزایش میدهد ، بنابراین نسبت 260 به 280 کاهش می یابد و خلوص آر. ان. اِی از بین می رود. برای نمونه های آر. ان. اِی و دی. ان. اِی نسبت 260 به 230 باید بالاتر از 2 و کمتر از 4/2 باشد. نسبت 260 به 230 پایینتر نشاندهنده آلودگی به پلی ساکارئیدها میباشد.
نسبت 260 به 240 برای اسیدهای نوکلئیک خاص باید حدود 4/1 باشد، این نسبت برای تعیین مقدار نمکها به کار می رود. وقتی نسبت 260 به 240 کمتر از 4/1 باشد، اسیدهای نوکلئیک باید چند بار با اتانول 70 درصد و در نهایت با اتانول 95 درصد شستشو شوند.
روش اسپکتوفتومتری
از روش دیگری نیز برای تعیین غلظت اسیدهای نوکلئیک استخراج شده استفاده میگردد و آن گرفتن جذب نوری نمونه ها در اسپکتوفتومتری است. در این روش بر اساس مقدار جذب نوری در طول موجهای خاصی از اشعه گاما میتوان مقدار دقیق دی. ان. اِی یا آر. ان. اِی و درصد خلوص آنها را در نمونه تعیین کرد. از این روش به طور متداول برای تعیین خلوص و مقدار اسید نوکلئیک در نمونه ها استفاده میشود. اسیدهای نوکلئیک با ترکیبی از 4 نوکلئوتید، عمدتاً نور فرابنفش با طول موج 260 نانومتر را جذب میکنند. پروتئینها که متداولترین آلوده کنندهی اضافی در نمونه های دی. ان. اِی و آر. ان. اِی میباشند، نور فرابنفش را در دو طول موج 260 و 280 نانومتر را جذب میکنند. زنجیره های پلی پپتیدی که معمولاً دارای 3 اسیدآمینه حلقوی باشند طول موج 280 نانومتر را جذب میکنند. اما برخی دیگر از پروتئینها چون هیستونها و یا پروتامینها که فاقد و یا دارای تعداد اندکی از اسیدآمینه حلقوی میباشند در طول موج 280 نانومتر فاقد و یا دارای حداقل جذب نوری میباشند. نسبت طول موج 260 به 280 نانومتر بایستی در دامنه 2 – 8/1 باشد تا بیانگر کیفیت مناسب دی. ان. اِی باشد. نسبتهای بالاتر از 2 بیانگر آلودگی آر. ان. اِی و نسبتهای زیر 8/1 بیانگر آلودگی پروتئینی میباشد. که هر یک واحد جذب در طول موج 260 نانومتر متناظر است با حدود 50 نانوگرم در یک سیسی از دی. ان. اِی دو رشتهای در یک کوِت، لذا از فرمول زیر میتوان برای تعیین غلظت دی. ان. اِی استفاده نمود.
ضریب رقت × 50 نانو گرم بر میلیلیتر × OD 260 = DNA (نانوگرم بر میکرولیتر)