تعیین غلظت DNA پس از استخراج

بررسی وجود DNA با استفاده از روش نانودراپ و اسپکتوفتومتری

نانودراپ

یکی از پیشرفتهایی که در زمینه دستگاههای اسپکتوفتومتری صورت گرفته، ساخت نانو دراپ می باشد. این دستگاه سرعت پردازش بالایی دارد و توانایی اندازه­ گیری طیف مرئی و UV را دارد و برای اندازه­ گیری، فقط به 1 میکرولیتر از نمونه مورد نیاز است. بعلاوه در اندازه­ گیری به این روش به وسایل دیگری به جزء سر میکروپیپت نیازی نیست . نانودراپ همچنین برای اندازه ­گیری غلظت پروتئین و رنگهای فلورسنت بکار می رود.

اسپکتروفتومتر نانودراپ، NanoDropTM این دستگاه بدون نیاز به کووت و تنها با استفاده از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موج­های موجود در طیف مورد نظر را با دقت 1 نانومتر، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند. با توجه به سرعت بسیار بالای دستگاه و میزان کم نمونه مصرفی، کاربران این دستگاه قادر خواهند بود ضمن صرفه­جویی در زمان و هزینه، بسیاری از آزمایشات ژنومیکس، پروتئومیکس و بیوشیمی را کنترل کیفی و بهینه نمایند.

ویژگی­های دستگاه:

قابلیت اندازه ­گیری غلظت و کیفیت اسیدهای نوکلئیک از 2ng/ml تا 3700 ng/ml بدون نیاز به رقیق­ سازی نمونه­

محدوده طول موج: 190 تا 840 nm – دقت جذب نوری 003/0 abs

اندازه­ گیری غلظت پروتئین­ها – اندازه ­گیری دانسیته سلول­ ها

اندازه­ گیری و تعیین غلظت دی. ان. اِی و آر. ان. اِی و اولیگونوکلئوتیدها در حجم یک میکرولیتر بدون احتیاج به رقیق ­سازی نمونه

اندازه­ گیری غلظت پروتئین­های خالص بصورت مستقیم

اندازه گیری غیرمستقیم غلظت میکس پروتئینی با رسم منحنی استاندارد

قابلیت ذخیره­ سازی اتوماتیک کلیه اندازه ­گیری ­­ها به تفیک جذب در هر نانومتر

دارای سیستم مونیتورینگ و عیب­یابی جهت آگاهی از کیفیت فیزیکی اجزاء دستگاه

تعیین خلوص اسید نوکلئیک

جذب در طول موج 260 نانومتر  به تنهایی اطلاعات کمی را در زمینه خلوص و کیفیت نمونه فراهم می کند. در صورت وجود آلودگی پروتئینی، آلودگی به حلال های آلی و نمک­ های و کربوهیدرات­ها، میزان جذب به طور معنی داری تغییر می کند. بنابراین محاسبه نسبت جذب 260 به 280 و نسبت 260 به 230 تعیین کننده خلوص اسیدهای نوکلئیک استخراجی می باشد.

  • برای نمونه­ های آر. ان. اِی نسبت 260به 280 برابر  1±2 و برای نمونه ­ها دی. ان. اِی نسبت 260 به 280 برابر  1±  8/1 قابل قبول است. غلظت 260 به 280 پائین­تر از 8/1 عموماً نشان­دهنده آلودگی پروتئین در طی مراحل استخراج می­ باشد. یکی از مشکلات در استخراج آر. ان. اِی و دی. ان. اِی حذف ناکامل پروتئین­ها از عصاره سلولی می باشد. پروتئین جذب در طول موج 280 را افزایش می­دهد ، بنابراین نسبت 260 به 280 کاهش می­ یابد و خلوص آر. ان. اِی  از بین می رود. برای  نمونه­ های آر. ان. اِی و دی. ان. اِی نسبت 260 به 230 باید بالاتر از 2 و کمتر از 4/2 باشد. نسبت 260 به 230 پایین­تر نشان­دهنده آلودگی به پلی­ ساکارئیدها می­باشد.

نسبت 260 به 240 برای اسیدهای نوکلئیک خاص باید حدود 4/1 باشد، این نسبت برای تعیین مقدار نمک­ها به کار می رود. وقتی نسبت 260 به 240 کمتر از 4/1 باشد، اسیدهای نوکلئیک  باید چند بار با اتانول 70 درصد و در نهایت با اتانول 95 درصد  شستشو شوند.

روش اسپکتوفتومتری

از روش دیگری نیز برای تعیین غلظت اسیدهای نوکلئیک استخراج شده استفاده می­گردد و آن گرفتن جذب نوری نمونه­ ها در اسپکتوفتومتری است. در این روش بر اساس مقدار جذب نوری در طول موج­های خاصی از اشعه گاما می­توان مقدار دقیق دی. ان. اِی یا آر. ان. اِی و درصد خلوص آن­ها را در نمونه تعیین کرد. از این روش به طور متداول برای تعیین خلوص و مقدار اسید نوکلئیک در نمونه­ ها استفاده می­شود. اسیدهای نوکلئیک با ترکیبی از 4 نوکلئوتید، عمدتاً نور فرابنفش با طول موج 260 نانومتر را جذب می­کنند. پروتئین­ها که متداول­ترین آلوده کننده­ی اضافی در نمونه­ های دی. ان. اِی و آر. ان. اِی می­باشند، نور فرابنفش را در دو طول موج 260 و 280 نانومتر را جذب می­کنند. زنجیره­ های پلی­ پپتیدی که معمولاً دارای 3 اسیدآمینه حلقوی باشند طول موج 280 نانومتر را جذب می­کنند. اما برخی دیگر از پروتئین­ها چون هیستون­ها و یا پروتامین­ها که فاقد و یا دارای تعداد اندکی از اسیدآمینه حلقوی می­باشند در طول موج 280 نانومتر فاقد و یا دارای حداقل جذب نوری می­باشند. نسبت طول موج 260 به 280 نانومتر بایستی در دامنه 2 – 8/1 باشد تا بیانگر کیفیت مناسب دی. ان. اِی باشد. نسبت­های بالاتر از 2 بیانگر آلودگی آر. ان. اِی و نسبت­های زیر 8/1 بیانگر آلودگی پروتئینی می­باشد. که هر یک واحد جذب در طول موج 260 نانومتر متناظر است با حدود 50 نانوگرم در یک سی­سی از دی. ان. اِی دو رشته­ای در یک کوِت، لذا از فرمول زیر می­توان برای تعیین غلظت دی. ان. اِی استفاده نمود.

ضریب رقت × 50 نانو گرم بر میلی­لیتر × OD 260 = DNA (نانوگرم بر میکرولیتر)