روشهای آزمایشگاهی استخراج DNA
روش کار بافر استخراجMax DNA
این بافر بصورتی طراحی شده که براحتی بتوان محتوای ژنتیکی بافت جدا شده از موجود زنده را بصورت DNA جدا سازی کرد
مزایا:
v آسان و سریع در مدت زمان 25 دقیقه
v مطمئن و بی خطر , در ترکیب مواد سازنده این بافر بر عکس همه محلولهای استخراج DNA هیچ ماده مضر و سمی بکار برده نشده است
v بدون استفاده از ازت مایع و یا هود قابل استفاده است
v برای استخراج DNA از هر بافتی که بصورت تازه از موجود زنده جدا شده قابل استفاده است
v درجۀ تخليص بالا: A260/A280>1.8
مراحل کار:
- میزان 100-50 میلی گرم از بافت تازه جدا شده از موجود زنده در اینجا برگ گیاه را در حاون استریل بخوبی به همراه 800-1000 میکرو لیتر از بافر ,سائیده بصورتی که محلولی همگن بوجود بیاید
تبصره: چنانچه از خون و یا سلولهای حیوانی و يا سلولهاي باکتري استفاده میشود جهت انجام کار به شرح بالا از رسوب 10 میلی لیتر نمونه خون و یا سلول و يا کشت شبانه باکتري استفاده شود و در صورت استفاده کمتر از 10 میلی لیتر نسبت بافر کاهش میابد.
- 200 میکرولیتر کلروفورم به مجموعه اضافه و به صورت بالا و پایین به شدت تکان داده داده میشود مدت زمان تکان دادن 15-10 ثانیه براورد میشود. سپس محلول همگن در محیط به مدت 10 دقیقه انکوبیت میشود
- تیوپ حاوی مواد و کلروفورم را در داخل سانتریفیوژ قرار داده و در سرعت rpm12000 بمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ میشود. پس از اتمام این مرحله دو فاز بصورت مشخص قابل مشاهده است که فاز شفاف رویی که حاوی DNAاست جدا شده و به داخل تیوپ دیگر منتقل و 800 میکرولیتر اتانوا 100% سرد به آن اضافه و بمدت 8 دقیقه در دمای اتاق انکوبیت میشود .
- در پایان تیوپ شبیه مرحله قبل سانتریفیوژ میشود. در این مرحله گاها لکه های بی رنگ و یا مایل به سفید در بدنه ویا کف تیوپ مشاهده میشود. میتوان سانتریفیوژ را با اضافه کردن اتانول 80% جهت شستشو تکرار و یا پس از خارج کردن اتانول و خشک کردن محتوای داخل تیوپ ( در این مرحله از روش air-dry استفاده میشود (50 میکرولیتر آب دوبار تقطیر به آن اضافه کرد و با پیپت DNA داخل تیوپ را حل کرد. جهت تست غلظت DNA میتوان 5 میکرولیتر آن را بر روی ژل الکتروفورز کرد.