آگروباکتريوم

تبديل T-DNA به ناقل ژن :

روشی که برای نخستين بار برای انتقال ژن به کمک سيستم “T-DNA،پلاسميدTi،اگروباکتريوم”بکار گرفته شد روش يکپارچه شدن (Cointegration)نام دارد. اين روش برای پرهيز از روبرو شدن با دشواريهای دستکاری قطعات بزرگ DNA– برای مثال به اندازه پلاسميد Ti –ابداع شد . نخست T-DNA را درون ناقل E-coli کلون مید و سپس ژن را در درون دومين مکان کلون ساز همين ناقل وارد می ساختند . آنگاه اين ناقل واسطه را به درون اگروباکتريومی که دارای پلاسميد دست نخورده Ti بود وارد می کردند . در اين حالت بين نواحی هومولوگ ناقل واسطه و پلاسميد نوع وحشی Ti نوترکيبي روی می دهد و به هنگام آلوده شدن گياه به اگروباکتريوم ، پلاسميد نوترکيب به سلولهای گياه انتقال می يابد .پلاسميد E.coli را که در اين فرايند مورد استفاده قرار می گيرد را اصطلاحا پلاسميد يکپارچه (Integrative Plasmid) می گويند يا ديگر تبديل به بخشی از پلاسميدTi شده است . امتياز اصلی اين گونه ناقلها زياد بودن پايداری آنها در درون اگروباکتريوم است ولی نياز داشتن به دانش دقيق از T-DNA پيش از دستکاری آن و همچنين ناچيز بودن نسبت يکپارچه شدن پلاسميدها از معايب ناقلهای يکپارچه محسوب می شوند .

اکنون روش استاندارد انتقال T-DNA ، سيستم دوتايي (Binary system) می باشد . اين شيوه هنگامی ابداع شد که پژهشگران دريافتند دستور های لازم برای انجام فرايند انتقال هم بوسيله پلاسميد Ti جداگانه صادر می شود و اجزای مزبور را می توان در ناقلهای جداگانه تعبيه کرد . ناقل دوتايي دارای کناره های 25 جفت بازی از توالی T-DNA می باشد که برای فرآيند برش و جداسازی به کار می آيند . در ناقلهای دوتايي ، ژنهای بيگانه بر روی يک پلاسميد اضافی که قابليت همانند سازی مستقل در اگروباکتريوم را داراست قرار می گيرند . مزيتهای اصلی ناقلهای مضاعف ، مستقل بودن آنها از نوع پلاسميدهای Ti و زياد بودن فراوانی انتقالشان به درون اگروباکتريوم می باشد . از آنجاييکه ژنها بيوسنتز کننده فيتوهورمون بر روی T-DNAی پلاسميد نوع وحشی Ti قرار دارند و در روند باززايي سلولهای گياه ايجاد تداخل می کنند پژوهشگران سيستم پلاسميد های تضعيف شده Ti(Disarmed Ti plasmids) را ابداع کردندکه به وسيله آن می توان ژنهای سازنده فيتو هورمون را از T-DNAحذف کرد تا جای خالی برای جدا سازی DNA ی بيگانه ای که قرار است به سلول گياه انتقال يابد فراهم شود. از اين گذشته حذف کردن ژن های سازنده فيتوهورمون از رشد لجام گسيخته سلولهای دريافت کننده ژن بيگانه جلوگيری می کند . ديگر ژنهای ضروری ، ژنهای vir پلاسميد Ti هستند . اين ژنها هنگامی می توانند در فرايند انتقال وارد شوندکه بر روی پلاسميد جداگانه ديگری به نام پلاسميد يدکی سوار شده باشند .

چون ژنهای مورد استفاده در آزمايشهای ترانسفورماسيون اغلب منشا گياهی دارند بايد علايم تنظيم کننده آنها را به گونه ای مناسب تصحيح کرد تا امکان نمود يافتن را در سلولهای گياهی پيدا کنند. لازمه اين کار برگزيدن پروموتر مناسب و قسمت های آغاز و پايان ترجمه می باشد .تا بدين وسيله نمود ژن با شدت مطلوب و بطور تخصصی بروز پيدا کنند .لازمه اين کار برگزيدن پروموتر مناسب و قسمت های آغاز و پايان ترجمه می باشد تا بدينوسيله نمود ژن با شدت مطلوب و بطور تخصصی بروز پيدا کند. اين ژنها شيمر هستند و اجزای مختلفی از منابع گوناگون را در خود جای داده اند . يکی از اجزای ضروری T-DNA ژن نشانگر می باشد که قابل گزينش است . ژن نشانگر اين توانايي را به سلولهای تغييرژن يافته می دهد تا در محيط کشت بافت که حاوی غلظت سمی از يک عامل گزينشگر می باشد همچنان به رشد خود ادامه دهد . يک سيستم قابل گزينش خوب برای ترانسفورماسيون گياهان بايد دارای اين ويژگی ها باشد : ساده بودن کارگزينش ، سمی نبودن برای بافت مقاوم گياه و به ارث رسيدن صفت در حالت غالب .

يکی از دلايل به کارگيری ناقلهای وابسته به T-DNA،توانايي حمل نشانگرهای قابل گزينشي همچون نئومايسين فسفوترانسفراز2(NPT2) و دی هيدروفولات رداکتاز می باشد .

اين نشانگر ها در درون تکرارهای 25 جفت بازی ناقل دوتايي جاطدارند و از اين روی آنها نيز به درون سلول گياه انتقال می يابند . ژن NPT2 از ترانسپوزون باکتريايي TN5 مشتق می شود و از طريق طک واکنش فسفوريلاسيون ، کانامايسين را غير فعال می سازد تا بدينوسيله امکان رشد و تمايز را برای سلولهای ترانسفورمه فراهم آورد . سيستم های قابل گزينش ديگری نيزوجود دارند که از ژنهای مقاومت به علفکش يا آنتی بيوتيک بهره می برند از جمله : مقومت به هيگرومايسين ، استرپتومايسين ، جنتامايسين ، فسفينوتريسين ، برومو کيسينيل و سولفوناميد . ناقلها اغلب نشانگر قابل گزينش ديگری هم در خود دارند که امکان دستکاری آنها در ايکولای را فراهم می آورد . ناقل های دوتايي سوای ناقلهای يکپارچه هستند زيرا پلاسميد دوتايي محتوی DNA ی بيگانه ، بصورت يک ناقل جدا گانه در اگروباکتريوم باقی می ماند .

نمونه ای از کاربرد سيستم دوتايي برای وارد ساختن ژنهای مطلوب به گياهان ، آزمايشهايي است که پژوهشگران با بهره گيری از Antisense RNA باهدف کنترل نمود يافتن ژن انجام داده اند . پلی گالاکتوروناز(PG) آنزيمی است که از راه هضم کردن پکتين ، ديواره سلولهای گياهی را در هم می شکند . اگر از ميزان نمود يافتگی پلی گالاکتوروناز کاسته شود ميوه ها کمتر دچار له شدگی و گنديدگی می شوند . بنابراين پژوهشگران قطعه ای از انتهای ‘5 ژن PG را در جهت عکس ، به همراه پروموتر به دست آمده از ويروس موزاييک کلم (CAMV)در درون يک ناقل دوتايي جداسازی کردند . سپس اين ناقل را به آگروباکتريوم و از آنجا به گياهان گوجه فرنگی انتقال دادند . ميوهای رسيده گياهانی که ژن به آنها انتقا يافته و حالت Antisense در آنها نمود پيدا کرده بود مورد آزمايش قرار گرفتند و معلوم شد که ميزان فعاليت آنزيم PG در آنها کاهش چشمگيری پيدا کرده است . ولی پژهشگران دريافتند که اين ميوه ها به همان نرمی و سستي گوجه فرنگی های وحشی هستند زيرا آنزيم PG تنها يکی از عوامل دست اندرکار نرم شدن ميوه ها به شمار می آيد . عامل ديگر ، هورمون اتيلن می باشد که اکنون پژهشگران با کار گذاشتن يک Antisense RNA برای آنزيمی که در مسير متابوليکی اتيلن وجود دارد توانسته اند از رسيدگی ميوه گوجه فرنگی جلوگيری کنند . توليد کنندگان می توانند چنين گوجه فرنگی هايي را بدون اينکه دچار له شدگی شوند با کشتی حمل کرده و سپس از اتيلن برای رسيدن آنها استفاده کنند .

ابراز ژن‌هاي بيماري‌زا و انتقال ژن

پردازش T-DNAو انتقال آن از آگروباکتريوم به به سلول گياهي، با فعاليت ژنهاي vir تنظيم ميشود. فعاليت ژنهاي بيماري زايي، با ترکيبات فنلي القا شده توسط زخم مثل acetosyringone و مولکول هاي مرتبط به آن، القا ميشود. به هر حال، شايد دانشمنداني بخواهند سطح القاي ژنهاي vir را بالاتر از ميزاني که توسط عصاره گياهي صورت ميگيرد، ببرند. چندين گروه چند جهش يافته هاي virA و virG را شناسايي کردهاند که به طور دائمي و در غياب ترکيبات القاکننده فنلي عمل ميکنند. جهشيافته دائمي virA توسط چند گروه تعيين خصوصيت شده است اما تاکيد بيشتري روي جهش يافته مستقل از القاکننده virG بوده است، شايد به خاطر اينکه عمل virG در پايين دست virA قرار گرفته است. مطالعات ژنتيکي گستردهاي منجر به شناسايي تعداد زيادي جهش يافته شده که در غياب ترکيبات القاکننده فنلي، فعال شدن پروتئين VirG در آنها صورت ميگيرد. اين پروتئين هاي تغييريافته داراي جهش هاي مختلفي هستند که يا آسپاراژين موقعيت 54 با اسيد آسپارتيک جايگزين شده (virGN54D) يا ايزولوسين موقعيت 106 به لوسين تغيير يافته است (virGI106L). هر دوي اين پروتئين هاي جهش يافته، خصوصاً زماني که از روي يک پلاسميد با “تعداد نسخه هاي زياد” ابراز شوند، سطح بالاي ابراز ژنهاي vir را تحريک ميکنند. در آزمون انتقال ژن موقت به توتون و ذرت، سويه هاي داراي جهشيافته virGN54D نسبت به سويه هايي که ژن virG طبيعي را رمز ميکنند، سطح انتقال ژن بالاتري نشان مي دهند. همچنين وقتي آلل virGN54D را به پلاسميدي با تعداد نسخه هاي زياد منتقل کنند، اثر آن بيشتر خواهد شد. حضور اين ژن جهشيافته در اگروباکتريوم، انتقال ژن موقت را در برنج و سويا، دو تا هفت برابر افزايش ميدهد.

چندين آزمايشگاه اثر تعداد نسخه هاي اضافي ژن virG طبيعي را بر القا ژنهاي vir و انتقال ژن به گياه بررسي کردهاند. Rogowsky و همکارانش نشان دادند که نسخه هاي اضافي virG نوع nopaline باعث افزايش ابراز ژنهاي vir ميشود. Liu و همکارانش نيز نشان دادند که تعدد نسخه هاي virG، الگوي پاسخ به pH را در القا ژن هاي vir تغيير ميدهد. در حالت عادي، القاي ژنهاي vir در pH خنثي و قليايي و در محيطهاي غني، بسيار پايين بوده ولي نسخه هاي اضافي ژن virG باعث القاي قابل توجهي در محيطهاي غني حتي در pH 5/8 ميشود. نسخه هاي اضافي virG همچنين فراواني انتقال ژن موقت در بافتهاي برنج، کرفس و هويج را مي افزايد.

بر اساس نتايج فوق، شايد اين طور به نظر رسد که افزايش تعداد نسخه هاي virA و virG يا کاهش وابستگي ابراز پروتئينها به القا کننده هاي فنلي، کارآيي انتقال سويه هاي حاصل را افزايش خواهد داد. اما احتمالاً اين موضوع پيچيدهتر از اين است. Belanger و همکارانش اعلام کردند که شايد ژنهاي virA در زمينه ژنتيکي خاصي بهتر عمل کنند و Krishnamohan و همکارانش نشان دادند که شايد پلاسميد Ti در مسير ترکيب بهينه virA، virG و جعبه هاي vir تکامل يافته باشد. همان طور که در بالا ذکر شد، پلاسميد Ti نوع pTiBo542در زمينه کروموزومي C58 توان بيماريزايي بيشتري در برخي گونه هاي بقولات دارد و اين موضوع احتمالاً به خاطر دخالت ژن virG بوده، اما در زمينه کروموزومي Bo542 اين طور نيست. القا ژنهاي vir و توليد رشته T احتمالاً همبستگي خوبي با کارآيي سويه هاي خاص آگروباکتريوم ندارد. A. tumefaciens A277 که داراي پلاسميد Ti نوع pTiBo542 در زمينه کروموزومي C58 ميباشد، نسبت به سويه هاي A348 و A208 که به ترتيب داراي پلاسميدهاي Ti نوع pTiA6 و pTiT37 در همان زمينه کروموزومي هستند، به طور قابل ملاحظهاي بيماريزايي بيشتري دارد. اما القاي ژنهاي vir با مواد مترشحه گياهي و توليد رشتهT در A. tumefaciens A208 بالاترين مقدار را دارد. اين دادهها حاکي از آن است که افزايش القاي ژنهاي vir و ساخت رشته T، لزوماً نشانگر خوبي براي کارآيي انتقال ژن نميباشد.

انتقال چند T-DNA به يک سلول گياهي و توليد گياهان تراريخته

به خاطر انتشار ژنهاي مقاومت به آنتي بيوتيک در طبيعت يا فرار ژن هاي مقاومت به علفکش به گونه هاي علفي وحشي، دانشمندان به دنبال راه حل هايي براي توليد گياهان تراريخته عاري از نشانگر هستند. اين گياهان در ابتدا بر مبناي مقاومت به آنتي بيوتيک و علفکش انتخاب شده ولي در مراحل بعدي دستورزي و رشد گياهان، نشانگر انتخابي برداشته خواهد شد. روشهاي مختلفي براي حذف نشانگر انتخابي از گياهان تراريخته اوليه پيشنهاد شده است. اين روشها شامل استفاده از سيستم نوترکيبي در جايگاه اختصاصي، مثل Cre-lox يا Flp-Frt براي برداشتن نشانگر، حرکت ترانسپوزوني نشانگر انتخابي از جايگاه اوليه خود پس از ورود به ژنوم گياهي، به طور کامل يا به جايگاهي غير مرتبط که در نسلهاي بعدي تفرق يابد، يا بهره برداري از چندين T-DNA که در جايگاههاي غير مرتبط وارد شده و در مراحل بعدي تفرق يابند، ميشود. هر کدام از اين سيستمها مزايا و معايب خود را دارند. به طور مثال، خروج ژن نشانگر با استفاده سيستم نوترکيبي جايگاه اختصاصي، به ورود آنزيم site-specific recombinase به داخل گياه به وسيله انتقال ژن يا تلاقي ژنتيکي نياز دارد. تفرق نشانگرها نيز فقط در نسلهاي گياهان تراريخته رخ داده و محدود به گونه هايي است که به طور طبيعي از طريق بذر تکثير ميشوند و شامل گياهان با تکثير رويشي نميشود.

تحقيقات اوليه درباره الگوي تفرق T-DNA در تومورهاي گال تاجي حاکي از آن است که دو T-DNA رمزشده توسط يک پلاسميد Ti نوع octopine ميتوانند به طور مستقل و در برخي اوقات در چند نسخه، وارد ژنوم گياه شوند. آناليز مولکولي نشان ميدهد که اين T-DNAها ميتوانستند در جايگاههاي غير مرتبط وارد شوند. اين نتايج نشاندهنده اين موضوع است که انتقال ژن توام براي ادغام تراژنهايي که توسط دو T-DNA مختلف حمل ميشوند، امکان پذير بوده و شايد اين T-DNAها در نسلهاي بعدي از همديگر تفرق يابند. در نتيجه سه رهيافت براي انتقال ژن توام استفاده ميشود:

الف) ورود دو T-DNA، هر کدام از يک باکتري مختلف؛

ب) ورود دو T-DNA که توسط رپليکونهاي جداگانه در يک باکتري حمل ميشوند؛

پ) ورود دو T-DNA که در بر روي يک رپليکون و در يک باکتري قرار گرفته اند.

آزمايشهاي اوليه با استفاده از اين سه رهيافت نشان ميدهد که انتقال ژن توام تکرارپذير است. An و همکارانش نشان دادند که مي توان انتقال ژن توام به سلولهاي توتون و ايجاد دو فنوتيپ مختلف را با استفاده از يک سويه آگروباکتريوم که داراي يک پلاسميد Ti بوده (رشد مستقل از فيتوهورمون) يا يک T-DNA ناقل دوتايي T-DNA (رشد مقاوم به کانامايسين)، انجام داد. اين آزمايش نمايانگر رهيافت يک سويه، دو رپليکون انتقال ژن است. وقتي سلولها براي مقاومت به آنتي بيوتيک مورد انتخاب قرار گرفتند، 10 تا 20 درصد آنها رشد مستقل از هورمونهاي گياهي نيز نشان دادند، در حاليکه اگر انتخاب اول براي رشد مستقل از هورمون هاي گياهي انجام مي گرفت، 60درصد کالوسهاي ايجاد شده، به کانامايسيم مقاوم بودند. اين محققان، معتقد بودند که دليل اين تفاوت فراواني، تعداد نسخه بيشتر (5 تا 10) ناقل دوتايي در باکتري، نسبت به تک نسخه پلاسميد Ti ميباشد.

اين آزمايشها توسط Frammond و همکارانش ادامه يافت و آنها توانستند از بافتهاي همسانه سازي شده توتون که به وسيله T-DNA از يک پلاسميد Ti و يک ميکرو Ti3]] (رهيافت يک سويه، دو رپليکون) انتقال ژن به آنها صورت گرفته بود، گياهان تراريخته بارور باززايي کنند. تفرق دو T-DNA در نتاج حاصل، نشان داد که T-DNAها در دو مکان ژني جداگانه ادغام شده بودند. گروه هاي ديگري رهيافت يک سويه، دو رپليکون را براي توليد گياهان تراريخته استفاده کردند که در ابتدا هر دو نشانگر T-DNAها ابراز شده ولي در ادامه اين دو نشانگر از يکديگر تفرق يافتند.

Depicker و همکارانش آزمايش مشابهي انجام دادند که نشانگرهاي انتخابي آن، رشد مستقل از هورمون هاي گياهي و ساخت nopaline (رمزشده توسط يک پلاسميد Ti) و رشد مقاوم به کانامايسين (رمزشده توسط يک ناقل دوتايي) بود. آنها آزمايش را از دو راه انجام دادند: يا دو T-DNA با دو سويه مختلف آگروباکتريوم منتقل شدند (رهيافت دو سويه، دو رپليکون)، يا هر دو T-DNA با يک رپليکون در يک سويه منقل شدند (رهيافت يک سويه، يک رپليکون). نتيجه آزمايشها اين بود که انتقال توام T-DNAها توسط يک پلاسميد در يک سويه به طور قابل ملاحظهاي کاراتر از انتقال توسط دو سويه متفاوت ميباشد. استفاده از يک سويه آگروباکتريوم و انتقال توام دو T-DNA از يک رپليکون مشابه و پيگيري تفرق ژن انتخابي تا توليد گياهان تراريخته عاري از نشانگر، توسط Komari و همکارانش و Xing و همکارانش نيز مورد بررسي قرار گرفته است. در هر کدام از اين مطالعات، محققان موفق به توليد گياهان تراريخته عاري از نشانگر با فراواني بالايي شدهاند.

استفاده از دو سويه مختلف آگروباکتريوم براي ارسال T-DNAهاي مختلف به يک سلول گياهي، توسط گروههاي متعددي انجام شده است. گرچه انتقال توام T-DNAها به جايگاههاي غير مرتبط ژنتيکي گزارش شده است، اما برخي محققان نشان داده اند که در بسياري از موارد، پيوستگي زيادي بين T-DNAهاي مختلف وجود دارد. بر اين اساس، هنوز کاملاً روشن نيست که کدام يک از اين رهيافت هاي انتقال ژن توام، براي توليد گياهان تراريخته عاري از نشانگر مناسب تر هستند.