الکتروفورز DNA

برای تایید انجام کارهای مهندسی ژنتیک با ید تغییراتی که روی  DNA ایجاد  شده است  رویت گردند، مشاهده DNA  متعافب الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی آکریلامید و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید امکان پذیر خواهد بود. برای انتخاب درصد آگارز از جدول شماره ۱  استفاده میشود:

جدول شماره ۱ – قدرت جداسازی مولکولهای DNA  توسط غلظتهای مختلف آگارز

درصد آگارز	قدرت جداسازی DNA
3	100-1000bp
2	200- 1500bp
1.5	300- 3000bp
1	500 – 5000bp
0.8	1000- 7000bp
0.6	10 – 30kbp
0.4	30 – 50kbp

تهیه  ژل  آگارز

1-  قالب ژل را آماده کنید

2- شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قراردهید

3- حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید ( اندازه گیری طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن کنید

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر 10 میلی لیترژل  یک میکرولیتر از محلول   10mg/ml  اتیدیوم بروماید اضافه کنید  سپس آن را خوب مخلوط کرده و داخل قالب بریزید

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید

7- هر 5 میکرولیترنمونه را با یک میکرولیتر بافر نمونه مخلوط کرده و داخل چاهک های ژل بریزید (این بافر حاوی 50درصد ماده سنگین کننده مانند گلیسرین یا ساکارز است که نمونه بخوبی داخل چاهک  ریخته میشود  و همچنین حاوی0.2 درصد از یک رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو یا گزیلن سیانول میباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحرکت میکند )

جدول شماره ۲ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل آگارز

درصد ژل آگارز	حرکت  تقریبی رنگ نشانه در مقایسه با مارکر	حرکت تقریبی  DNA   در مقایسه با مارکر
برومو فنل بلو	Xylen cyanol
0.4	500bh	3kbp	2.5kbp
0.8	500bp	3kbp	1kbp
1	500bp	3kbp	500bp
1.25	500bp	3kbp	250bp
1.5	100bp	1kbp	250bp
2	100bp	1kbp	100bp

جدول شماره ۳ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل  پلی آکریلا مید

درصد ژل پلی آکریلامید	حرکت  تقریبی رنگ نشانه  در مقایسه با مارکر	حرکت تقریبی  DNA  در مقایسه با مارکر
برومو فنل بلو	Xylen cyanol
3.5	100bp	500bp	100bp
5	75bp	250bp	75bp
8	50bp	250bp	50bp
12	25bp	75bp	25bp
15	10bp	60bp	25bp
20	10bp	60bp	5bp

8.- بافر تانک باید کاملا” روی  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهک ها ریخته شوند. (از بافرهای مختلف استفاده میگردد.   بهتر است هنگام الکتروفورز به ازای هر میلی لیتر بافر تانک  (TBE buffer) یک میکرو لیتر از اتیدیوم بروماید 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید  نمونه بطرف قطب منفی با شد  تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند

10- تانک الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل کنید

11-  پیچ Current را روی ماکزیمم قرار داده و ولتاژ را تنظیم کنید (10V/centimetr )

وقتی رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طی کرد ژل را از تانک خارج کرده بانورUV نتیجه را مشاهده کنید .